第五章-基因克隆的载体系统2014

第五章基因克隆的载体系统概述1、载体（vector）概念能将外源DNA分子携带进入宿主细胞,并进行复制或表达的工具称为载体。用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。按功能分为克隆载体和表达载体。载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2载体的特点能在宿主细胞内独立复制；有选择标记，易于识别和筛选；可插入一段较大的外源DNA分子而不影响自身复制；有合适的限制性酶切位点第一节克隆载体用于携带DNA片断进入宿主细胞进行复制或保存的载体称为克隆载体。主要的克隆载体质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体单链DNA噬菌体载体噬菌粒载体动物病毒一、质粒载体（一）质粒一般生物学特性１质粒的概念质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的(酵母的杀伤质粒是一种RNA)质粒DNA的分子量范围：1-300kb２主要构型SC构型cccDNAOC构型开环DNAL构型线性DNA3质粒的基本特性1）自主复制性复制起始区（replicationorigin)：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点（2）质粒的拷贝数拷贝数:常指生长在标准培养基条件下,每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目.根据质粒在寄主细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为松弛型（relaxedcontrol）:10~60copies,高拷贝严紧型（strigentcontorl）:1~几个copies,低拷贝质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20（3）、质粒的不相容性（plasmidsincompatibility)在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主体系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性.在细胞的增殖过程中,其中必有一种会被逐渐地排斥掉,不相容性的质粒组成不相容性群.ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容根据质粒DNA中是否含有接合转移基因分为接合型质粒（能自我转移）：又叫自我转移型质粒，除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞非接合型质粒（不能自我转移）：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞（4）可转移性（二）质粒载体的构建及类型1、天然质粒用做克隆载体的局限性2、质粒载体必须具备的基本条件3、质粒载体的选择标记4、不同类型的质粒载体1、天然质粒用做克隆载体的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建2、质粒载体必须具备的基本条件具有复制起点具有抗菌素抗性标记具有若干限制性单一酶切位点(多克隆位点(mutiplecloningsite简称MCS)。具有较小的分子量和较高的拷贝数3、质粒载体的选择标记氨苄青霉素(Amp)氯霉素(Cml)卡那霉素(Kam)链霉素(Sm)四环素(Tet)筛选标记蓝白斑筛选插入失活4、不同类型的质粒载体高拷贝数的质粒载体(ColE1、pMB1):拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝数的质粒载体(F因子、pSC101):来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因失控的质粒载体:一类温度敏感型复制控制质粒插入失活型的质粒载体:载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329正选择的质粒载体:直接选择转化后的细胞.只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长，如pUR2、pTR262等表达型质粒载体:在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应的蛋白质的克隆载体特称为表达载体.5、常用的大肠杆菌质粒载体pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr1）元件来源复制起点:来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点Ampr基因:来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr基因Tetr基因:来源于pSC101的Tetr基因pBR322的优点①具氨苄青霉素和四环素双抗菌素抗性选择标记②分子小，克隆能力大载体越小越好，10kb的DNA在纯化过程中容易断裂③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点，能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移。BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpBR322改造而来通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBr5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galabb-半乳糖苷酶的a-肽段ClBrClBrONNPlacMCSlacZ兰-白斑筛选如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。PUC质粒的优点:具有更小的分子量和更高的拷贝数适用于组织化学方法检测重组体具有多克隆位点MCS区段MCSlacZ’PT7PSP6oripGEM-3Z2743bpApr注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等多拷贝多克隆位点正选择颜色标记lacZ具有两个噬菌体强启动子用于外源基因的高效表达在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记,可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-动物细胞穿梭载体（五）质粒载体的稳定性问题质粒稳定遗传必须的两个条件（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中1、结构不稳定性:寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。2、分离的不稳定性:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。（六）影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢负荷;质粒载体的拷贝数;寄主菌的重组体系二、噬菌体(bacteriophage)载体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体噬菌体一般生物学特性大多数多呈带尾部的二十面体.如λ噬菌体,部分为线状体型.如M13噬菌体颗粒的外壳是蛋白质分子,内部是核酸,常见的是双链DNA核酸相对分子量相差较大感染率极高生命周期可分为溶菌周期和溶源周期（一）噬菌体的一般特性1.噬菌体的基本功能2.结构及核酸类型3.噬菌体的感染性4.溶菌周期5.溶源周期6.重组噬菌体的分离1溶菌周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2溶源周期感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。只有双链DNA的噬菌体才有溶源周期.温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体.溶源性细菌:具有一套完整的噬菌体基因组的细菌.溶源化:用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合:噬菌体的DNA被包容在寄主细菌染色体DNA之中,便叫做已整合的噬菌体DNA原噬菌体:在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA,叫原噬菌体,原噬菌体中如有某些基因缺失了,称之为缺陷性的原噬菌体lysogenicstate:噬菌体侵染宿主细胞后，将λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中，并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态。溶源细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染.抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性.经过许多世代之后,溶源性的细菌便能开始进入溶菌周期,这个过程叫做溶源性细菌的诱发溶源细菌有两个重要特点:（二）单链DNA噬菌体载体（M13）1、生物学特性2、M13克隆体系3、噬菌体展示载体生物学特性噬菌体的外型呈丝状由外壳包装蛋白和(+)DNA组成基因组为单链DNA;不裂解宿主细胞，但抑制其生长DNA上至少有10个基因不存在包装限制。M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌，但M13DNA可以转染雌性大肠杆菌，颗粒内含有长6407bp的闭合环状DNA基因组。M13的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因组。M13通过细菌的纤毛插入大肠杆菌，单链分子作为模板合成互补链，形成双链DNA分子。转染:感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代；感染:病原微生物在寄主组织内立足的状态复制型DNA(ReplicativeformDNA):在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，这种双链DNA称为复制型DNA。M13载体的构建在M13基因组中有一段507个核苷酸区域的间隔序列,称为IS区;在其间插入序列不受影响插入LacZ’,编码B-半乳糖苷酶前面146个氨基酸,含有其操纵基因和启动子区,插入接头M13DNA载体的特点：优点有MCS，便于克隆不同的酶切片段Xgal显色反应，可供直接选择无包装限制，克隆能力大可以克隆双链DNA分子中的每一条链缺点插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降实际克隆能力小于1500bp(三)、双链噬菌体载体研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体l噬菌体的生物学特性线状双链DNA分子l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因两端各有12bp的粘性末端噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用a.具有互补粘性的λDNA分子b.通过粘性末端环化了的DNA分子粘性末端形成的双链区域称为cos位点细胞内环化形式的野生型噬菌体基因图野生型做为克隆载体的缺点:限制性内切酶有较多的切割位点l-DNA载体的构建：去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点野生型l-DNA有包装限制，l噬菌体的包装能力控制在野生型的75%到105%（36-51kb）。必须区是28kb，所以l载体的最大克隆容量是23kb插入选择标记基因cI失活，Spi筛选和LacZ蓝白斑筛选建立重组lDNA分子的体外包装系统根据切除的多少，可将l-DNA分成