酵母双杂交

酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统的简介酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)是由Fields和song等在1989年提出的一种在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)•这两个结构域各具功能，互不影响,•单独存在时都没有转录激活的功能，•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。二、酵母双杂交系统的建立Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。酵母Gal4的结构1147768881DBD（DNA-bindingdomain）(AD)ActivationDomainDBD（DNA-bindingdomain）：DNA结合结构域AD（activationdomain）：转录激活结构域Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合；Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。酵母转录因子（Gal4）与BD-fusion---诱饵蛋白（baitprotein）与AD-fusion---猎物或靶蛋白（preyortargetprotein）报告基因（reportergene）---LacZ（编码β-半乳糖苷酶）酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合报道株经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。三、酵母双杂交系统的原理•可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白质X和Y的相互作用。酵母Gal4基因转录表达Gal4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。钓饵蛋白目的蛋白（靶蛋白）假设将X、Y蛋白分别与转录因子的DBD和AD融合产生新的融合蛋白。酵母双杂交载体及菌株共转化至酵母菌株如果这两个蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使DBD和AD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记（如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长）或编码酶的基因（MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶）组成。检测LacZ活性阳性克隆可诱导产生高水平的ß-半乳糖苷酶。该酶在X-gal存在的情况下现色反应呈蓝色。筛选四、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。2.真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简捷性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质等的繁琐步骤。4.广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。五、酵母双杂交的应用酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途径。用已知基因作诱饵，利用酵母双杂交系统在选定的cDNA文库中筛选与其相互作用的新蛋白，再从酵母中分离得到AD-Library载体，对其进行测序并在GenBank中进行比较，可以得到与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。2、在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，研究抗原和抗体之间的相互作用。但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用，而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。3、筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响4、建立基因组蛋白连锁图众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系，通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。Dyer等通过酵母双杂交技术，绘制出了人与致病性细菌蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人与致病菌间的相互作用关系奠定了基础。六、存在的问题及改进（一）假阳性较多（二）转化效率偏低（三）阴性干扰假阳性定义在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。（一）假阳性较多①BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。③AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；④AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因：排除假阳性的措施①作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。②采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。③报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。解决措施：引进酵母接合型（二）转化效率偏低单倍体接合型酵母α和a，二者融合可以产生二倍体细胞。（三）阴性干扰•融合蛋白的表达对细胞有毒性，应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体•蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。诱因及措施：