紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书

紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书北京普析通用仪器有限责任公司应用技术部2004年7月目录前言：..........................................................................................................11．蛋白质/DNA浓度测定的意义............................................................12．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理........................................12.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理.....................................12.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理......................................23．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法........................................23.1纯蛋白质浓度的测定方法............................................................23.2纯DNA浓度的测定方法.............................................................43.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法.....................................54．UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法.....................74.1．启动DNA蛋白质测定功能.......................................................74.2．设置测量参数..............................................................................84.3．处理测量结果..............................................................................95．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素................................96．测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介..................................11紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书1前言：本书将主要介绍紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理、方法以及在测定过程中的一些影响因素，并对其他一些使用化学试剂测定蛋白质/DNA的方法进行了讨论，旨在对用户测定蛋白质/DNA时有一定的指导意义。1．蛋白质/DNA浓度测定的意义“21世纪是生物科学的世纪”！随着克隆羊的成功，随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等，而基因组学、蛋白质组学的最基本的研究单位就是蛋白质和DNA。因此，蛋白质和DNA浓度的测定方法，成为生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。紫外吸收法是在不引入化学试剂的情况下，直接利用待测物质在紫外区的吸收性质，来测定其浓度的方法。该方法因测量简单、快速，不需要试剂，更为重要的是它不破坏待测样品，因此越来越受到重视，并被广泛应用。2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理2.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理蛋白质为生物大分子，所产生的紫外吸收往往是其分子内的小紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书2基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。1．在蛋白质分子中，酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）残基的苯环含有共轭双键，该共轭双键对紫外光有吸收（其中最大吸收Tyr在274nm；Phe在257nm；Trp在280nm），从而导致该蛋白质对紫外光有吸收，且其吸光度值与这三种氨基酸的浓度相关，从而与蛋白质的浓度相关。2．肽键对紫外光有吸收（其最大吸收在238nm），因此蛋白质溶液在238nm的光吸收值与其肽键含量成正比，从而与蛋白质溶液的浓度相关。2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理DNA也为生物大分子，所产生的紫外吸收也是其分子内的小基团所引起的，例如嘌呤碱、嘧啶碱等等。嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷、核苷酸及核酸（DNA&RNA）对紫外光都有强烈的吸收作用。它们吸收紫外光的共同特点是在260nm处为最大吸收值。3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法3.1纯蛋白质浓度的测定方法1．280nm下的光吸收法这是最常用的测定蛋白质浓度的紫外吸收法。方法依据：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，而且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书3大，所以很多蛋白的浓度与A280成正比。测定方法：测定蛋白质标准溶液在280nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在280nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。方法的缺点：（1）干扰物质较多，高浓度的盐（如NaCI）、含有共轭双键的有机溶剂、核酸都会对测量结果产生干扰。因此本方法一般只适用于纯蛋白溶液（不含其他盐类或其他盐类浓度非常低）。（2）目标蛋白与标准蛋白中所含上述三种氨基酸的含量差别较大时，测量结果将会产生大的偏差。值得注意的是，目前该方法的应用已经非常广泛，很多蛋白在一定浓度和一定波长下的吸光度A值都有文献数据可查，因此将所测吸光度A值结合文献数据即可以计算出相应的蛋白质浓度。2．肽键测定法（A238法）蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比，故此法称为A238法。（有时也可以使用A230法取代）测定方法：测定蛋白质标准溶液在238nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在238nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。A238法比A280法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐、无机碱或水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书4方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。3．215nm和225nm下的光吸收差法：本方法为一个经验公式。蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm下的光吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。吸收差=A215－A225测定方法：测定蛋白质标准溶液在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差，以对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差，通过标准曲线法计算出样品浓度。在蛋白质浓度20~100g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度差值成正比，其中NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1NNaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。3.2纯DNA浓度的测定方法DNA在260nm下有最大吸收，且A260值与DNA的浓度成正比例关系。因此，可以根据DNA溶液的A260值来计算DNA溶液的浓度。测定方法：测定DNA标准溶液在260nm处的吸收值A，以A对DNA标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在260nm处紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书5的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。缺乏DNA标准溶液时，可以利用下面的经验公式来计算：C＝50×A260（ug/mL）DNA浓度较低时（20—200ug/mL），上述经验公式线性相关性较好。同时，如果存在高浓度的盐、带共轭双键的有机溶剂和蛋白质，都会对测量结果产生影响。3.3蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法蛋白质和核酸（DNA&RNA）是生物体内最重要的两种物质，绝大多数生物体内都含有大量的蛋白质和核酸，而且两者紧密相关，互为依存。从生物体内提取蛋白质时，通常混有核酸；从生物体内提取核酸时，又通常混有蛋白质，而两者在紫外区又都有吸收，所以在测定其浓度时，如果采用上述纯溶液的测定方法，都会对对方有干扰。因此，针对这种情况，形成了一些专门测定蛋白质/DNA混合溶液浓度的方法。1．280nm和260nm下的光吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍，在260nm处的吸收更强，核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍。而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。依照蛋白质和核酸分别在260nm和280nm处吸光度的差异，可以依据A280/A260判断蛋白质和核酸的比例，如下：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A2601.8蛋白质核酸混合溶液：A280/A2601.8～0.5紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书6纯核酸的光吸收比值：A280/A2600.5测定方法：对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液，直接在260nm和280nm下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：蛋白质浓度＝1552×A280－757.3×A260(ug/ml)DNA浓度＝62.9×A260－36.0×A280(ug/ml)注意：（1）该公式为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情况还需要修正；（2）该方法受很多干扰物质的影响，前文所述纯溶液测定方法的干扰物质都会对本方法产生干扰，如高浓度的盐（如NaCI）和含有共轭双键的有机溶剂等等。2．230nm和260nm下的光吸收差法依前文所述，蛋白质中肽键在238nm下有最大吸收值，可以取A230作为其一个近似值，同时核酸在230nm附近也有较强吸收，因此，对于蛋白质和核酸（以DNA为代表）的混合溶液，可分别测定其A230和A260。测定方法：直接在230nm和260nm下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度：蛋白质浓度＝183.0×A230－75.8×A260(ug/ml)DNA浓度＝49.1×A260－3.48×A230(ug/ml)与A280/A260光吸收差法类似，该公式也是为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书7况也需要修正。与A280/A260光吸收差法相比，此方法具有更高的精确度，同时干扰物质也更多，除了高浓度盐、带共轭双键的有机物之外，一些醇、有机酸和过氧化物也会产生干扰。4．UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法由于紫外吸收法测量蛋白质/DNA浓度被广泛应用，北京普析通用仪器有限责任公司在紫外可见分光光度计专用软件UVWin5.0上专门为其设计了一个软件包，该软件包综合了上述所有的紫外吸收法测定蛋白质浓度的方法，其中将最常用的测定蛋白质/DNA混合溶液的方法形成两个专用方法，分别为方法1（“A230/A260法”）和方法2（“A280/A260法”），同时还预留了一个自定义模块供用户根据实际情况和需求，自己设计检测波长和进行差值运算的系数。另外，基于蛋白质/DNA在320nm之上均没有光吸收的原理，该软件还设计了一个“波长320nm背景校正”的可选功能，以方便用户能够更好地选择合适的测定方法。总的来说，UVWin5.0蛋白质/DNA测定专用软件包基本上涵盖了所有的可以根据紫外吸收来测定蛋白质/DNA浓度的方法。软件的具体操作方法如下：4.1．启动DNA蛋