柱色谱分离实验

柱色谱ColumnChromatography了解：1.柱色谱法分离有机物的原理。2．固定相和流动相的选择原则。掌握：1.色谱柱的填充方法。2．柱色谱分离的基本操作。一、实验目的色谱法简介色谱法亦称色层法，层析法等，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一，还可定量分析。色谱法分类固定相、流动相的物理状态操作形式分离原理液—固色谱法气—固色谱法气—液色谱法液—液色谱法柱色谱法（columnchromatography）薄层色谱法（TLC）纸色谱法（paperchromatography）气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法排阻色谱操作形式柱色谱法（columnchromatography）二、实验原理柱色谱分离示意图混合物吸附剂(固定相)洗脱剂(流动相)二、实验原理二、实验原理吸附剂的性质：均匀、表面积大、不反应、吸附能力不同化合物的结构：化合物的吸附性和它们的极性成正比洗脱剂的极性：溶解度适中、不反应、易获取回收影响分离效果主要因素和和在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？三、实验内容装柱加样洗脱收集鉴定•干法：10g硅胶+乙醇•先用乙醇后用水•操作•组分颜色•组分颜色•1mL样品•加样操作•0.5mL×2乙醇洗涤柱色谱操作：实验步骤:吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。干法装柱湿法装柱装柱装柱装柱装柱三、实验内容•装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面．样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面。加样三、实验内容洗脱在柱顶不断加入洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干，使流动相流速适当。三、实验内容•洗脱时应注意：•（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带分离。•（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！•（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。•（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。•（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。试样有色，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。收集试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，分离效果越好。三、实验内容三、实验内容鉴定试样有色依据颜色直接鉴定试样无色可结合薄层色谱结果•玻砂防堵塞•装柱需紧密•加压不可大•溶剂勿流干四、注意事项色谱法在有机化学中的应用:分离混合物精制提纯化合物利用比移值(Rf)鉴定化合物跟踪反应进程小结色谱法的特点:分离效率高复杂混合物,同系物,异构体等。灵敏度高可以检测出μg•g-1(10-6)级甚至ng•g-1(10-9)级的物质量。分析速度快几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。小结柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝实验原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实验以硅胶为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。三、实验内容装柱加样洗脱收集鉴定•干法：10g硅胶+乙醇•先用乙醇后用水•操作•组分颜色•组分颜色•1mL样品•加样操作•0.5mL×2乙醇洗涤柱色谱操作：实验步骤:仪器和试剂•1.仪器•锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱•2.试剂•柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲基橙、亚甲基蓝。•H2O∶95%乙醇=1∶1(A液)•0.2mol·L-1HCl∶95%乙醇=1∶1(B液)装置图装柱洗脱实验步骤•装柱：•1、装色谱柱：•（1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂直固定在铁架台上。•(2)关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水（也是洗脱剂，至柱体积的1/2）•（3）填吸附剂：称取10g硅胶于小烧杯中,加入15mL蒸馏水,用玻璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱,使其逐渐沉入底部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，打开活塞，用小锥型瓶承接,控制滴速为1滴／秒,装完后在上面加一层脱脂棉（，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。实验步骤（续）•加样：当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞，加入5mL左右的A液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用量筒准确加入0.50mL以A液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400g·L-1)。•洗脱：待此混合液将要渗入柱内时,立即用A液洗脱,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移,而其顶部蓝色带不移动,当黄色带到达柱底部时,更换接受器,全部收集此黄色带,洗脱时间约10min。此后改用B液做洗脱剂,这时可看到蓝色带开始下移,当亚甲基蓝色带到达底部时,更换接受器,全部收集此蓝色带,洗脱时间约30min。•