超高分辨率显微镜简介

超高分辨率显微镜简介2阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。3阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山4阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限。电镜是否绕过了阿贝定律，突破光学极限了呢？没有!电镜使用了更短的入射光波长。6传统显微镜局限1.传统光学显微镜观察细胞内器官/病毒/寄生虫三维空间精确定位和分布蛋白质结构/定位/功能关系,蛋白质-蛋白质相互作用时空顺序活性因子调节细胞生命活动以上活动均在nm量级,而传统光学显微镜在水平200nm,Z轴500nm范畴2.电子显微镜能观察细胞内囊泡/线粒体定位,但缺乏特异性探针,不适合定位单个蛋白质分子,不能对活细胞观察7超高分辨率成像技术Stimulatedemissiondepletion(STED)StructuredIlluminationMicroscopy(SIM)Single-MoleculeLocalizationMicroscopy–photoactivatedlocalizationmicroscopy(PALM)–stochasticopticalreconstructionmicroscopy(STORM)–fluorescentphotoactivationlocalizationmicroscopy(FPALM)8一.STED9STED原理:1011STED以光制光1蓝激光激发出绿光2用红激光产生受激发射（甜甜圈）3红绿两色同时产生，用滤光片过滤红色4获得小于200nm的绿色光斑1994年理论提出2008年商品化12实际样品成像测试图片由IBP季伟老师提供13二.SIMUniversityofCalifornia,MatsG.L.Gustafsson提出14SIM原理15SIM原理16SIM17三.单分子定位显微成像技术PALM/STORM基于全内反射荧光(TIRF)成像技术：有效减少背景信号及有利于单分子荧光信号的采集TIRF=TotalInternalReflectionFluorescence18单分子质心确定—数学运算19TIRF全内反射荧光TIRF原理:Snells’Law介质面θ1θ’1θ1=θ’1(反射)n2n1EPIn1n2θ2n1n2n1=n2θc90oTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统Snells’Law光入射到不同介质的界面上会发生反射和折射当入射角为临界角时，光沿介质表面传播当入射角大于临界角时，发生全反射现象WFC.A.TIRFTIRF原理:消逝波和渗透深度TIRF渗透深度50–300nmZ消逝波:z轴强度指数性衰减211TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统利用消逝波可以对贴壁细胞50-300nm内的荧光标记物质进行荧光观察。分子扩散•信使/转运分子动力学•膜融合•细胞/细胞的相互作用•细胞骨架动力学囊泡运动、溶酶体、胞吞胞吐单分子检测TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统©OLYMPUSSOFTIMAGINGSOLUTIONSGMBH08/12/2014Page25为什么白天看不到星星?TIRF示例一WFTIRFTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例一TIRF：微丝的生发宽场TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例二：囊泡的释放TIRF示例三：细胞的运动TIRF：ActinRunConfocal：ActinRunTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例四：模拟癌细胞沉降TIRF示例五：溶酶体酸性物质的释放TIRF技术，让我们以极高的信噪比对超薄Z轴空间（50nm）的荧光进行检测超高的信噪比让我们可以检测到单分子检测到单分子，基于此，有了单分子定位超高分辨率技术TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统33A.STORM34STORM庄晓威2006年提出的方法基于高精度光转化荧光蛋白定位的一种超高分辨率方法。352006年，哈佛大学庄小威从化学生物学角度提出了她的新方法，利用荧光探针家族，实现了随机光学重建显微法。StochasticOpticalReconstructionMicroscopy核心原理是利用光线“开关”，“随机”地让被观测物体上的点发光或熄灭，这样就拉远了两个发光点之间的距离，相机不断动态捕捉这样的成像，再经过计算机分析，就会形成被观测物体整体的图像36ManyMolecules37TheprincipleofSTORM38TheprincipleofSTORM39TheprincipleofSTORM40TheprincipleofSTORM41TheprincipleofSTORM42TheprincipleofSTORM43TheprincipleofSTORM44TheprincipleofSTORM45TheprincipleofSTORM46TheprincipleofSTORM47TheprincipleofSTORM48TheprincipleofSTORMTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统点描法(点彩派画法)LaParadedeCirque(1889)TheSundayAfternoonontheIslandofLaGrandeJatte(1884–1886)点分布函数(PSF),信噪比(S/N)决定计算分辨率样点量决定计算分辨率TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统样品准备(重要性50%)合适条件促发‘闪烁点’并成像记录从多样性的算法中选择合适的1.TIRF公认的最佳光学质量.筛选符合要求的‘闪烁点’重建突破光学衍射限制(超分辨率)的图像TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统白天不适合放烟火不适合短时间内放太多,或长时间内放太少发射和拍摄的精确控制后期处理成功的烟火晚会Seriesofafewthousandimagesareacquired.*Criticallydependsonthelabelingdensityandtheimagedbiologicalstructure.ParticledetectionandimagereconstructionusingImageJandQuickPALMplugin.OriginalDataCourtesyofColinRickman:CentreforIntegrativePhysiology,UniversityofEdinburghDr.ColinRickman,Heriot-WattUniversity54B.PALM55B.PALMEricBetzig、HaraldHess以及JenniferLippincott-Schwartz小组2006年开发出的一种新的方法，与STORM相似所用荧光探针不同5657PALM图片58PALM图片由北京大学陈良怡老师提供TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统常用超分辨率显微镜技术分辨能力比较SchermellehLetal.JCellBiol2010;190:165-175TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统有没有更方便的超高分辨率技术？1、没有特殊染料限制常规染料就可观察？2、不需要重复激活、灭活，一次成像即可获得？3、可同时进行双通道超高分辨率成像？4、可观察活细胞？5、可观察任意层面超分图像，无标本厚薄限制？6、可与共聚焦匹配，一键切换？TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统最新超分辨技术SchermellehLetal.JCellBiol2010;190:165-175共聚焦TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统最新超分辨技术SchermellehLetal.JCellBiol2010;190:165-175超高分辨率120nmTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统FV-OSRTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统FV-OSR更多精彩，敬请期待