昆虫肠道微生物多样性研究进展

河南农业科学，2016,45(11):1-7JournalofHenanAgriculturalSciencesd〇i：10.15933/j.cnki.1004-3268.2016.11.001昆虫肠道微生物多样性研究进展鲁迎新\刘彦群\李群\夏润玺\王欢(1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110161;2.沈阳工学院，辽宁抚顺113122)摘要：昆虫肠道内存在种类繁多、数量庞大的微生物，这些肠道微生物种群结构的多样性与昆虫种类、龄期、消化道形态、食物的喂养条件、生存环境等息息相关。近几年，随着大规模测序技术、组学技术的发展，应用分子生物学技术快速、定性、定量研究昆虫肠道微生物种群的多样性已成为热点。介绍了昆虫肠道微生物的分类和检测方法，综述了昆虫肠道微生物多样性的研究进展，以期为昆虫与其肠道微生物的协同进化和害虫防治等研究提供基本方法和数据，为今后昆虫肠道微生物的研究提供理论参考。关键词：昆虫；肠道微生物；多样性；检测方法中图分类号：Q938文献标志码：A文章编号：1004-3268(2016)11-0001-07ResearchProgressonIntestinalMicrobialDiversityofInsectsLUYingxin1，LIUYanqun1，LIQun1，XIARunxi1，WANGHuan1’2**(1.CollegeofBioscienceandBiotechnology,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China；2.ShenyangInstituteofTechnology,Fushun113122,China)Abstract：Thereareawidevarietyandlargenumberofmicrobesininsectgut.Thepopulationdiversityofintestinalmicrobesisrelatedtoinsectspecies,age,intestinalmorphology,food,feedingconditionsandlivingenvironment,etc.Inrecentyears,rapid,qualitativeandquantitativestudyofintestinalmicrobialdiversitybymolecularbiologytechniqueshasbecomeahotspotwiththedevelopmentofthelarge-scalesequencingandomicstechnologies.Inthispaper,theclassificationanddetectionmethodoftheinsectintestinalmicrobesweredescribed,andtheprogressonintestinalmicrobialdiversityofinsectswasreviewed.Thosewouldprovidebasicdataandmethodsforresearchofinsectgutmicrobesandpestcontrol.Keywords：insect；intestinalmicrobes;diversity；detectionmethod昆虫是全球最多样化、数量最多、进化历史最悠久、分布最广泛的动物之一[1]，而这些特征与昆虫的共生物以及生存环境密不可分。昆虫的共生物，尤其是肠道微生物能够提高贫瘠食物的营养、帮助消化食物，提高对天敌、寄生虫和病原菌的防护，影响昆虫种间、种内物质交流，传播疾病，甚至具有调控交配和生殖系统的功能[2_3]。昆虫的肠道伴随取食、消化、排泄等活动，是一个可变的动态环境[4]，肠道微生物的结构、数量和种类也富于动态变化，这些变化都会对昆虫产生一定的影响，因此已经有很多学者从微生态学角度研究昆虫与肠道微生物的共生关系[5_6]。近几年随着大规模测序技术、组学技术的发展，生命科学也步人了“大数据”时代，应用分子生物学技术快速、定性、定量研究昆虫肠道微生物种群的多样性已经成为热点。综述了昆虫肠道微生物多样性的研究进展，以期为昆虫与其肠道微生物的协同进化和害虫防治等研究提供基本方法和数据，为今后昆虫肠道微生物的研究提供理论参考。收稿日期=2016-06-11基金项目：国家自然科学基金项目（30800803);辽宁省大学生创新训练项目（201413201014)作者简介：鲁迎新（1992-)，女，辽宁朝阳人，在读硕士研究生，研究方向：动物细胞与分子生物学。E-mail：[e-mail]*通讯作者：王欢（1977-)，女，辽宁沈阳人，副教授，博士，主要从事昆虫病理与生物防治研究。E-mail：[e-mail]2河南农业科学第45卷1昆虫肠道微生物的种类昆虫肠道微生物可根据其在肠道内生存定居的时间及其与昆虫的关系进行分类[7_8]。在肠道占有特定区域的微生物是常驻微生物群落（autochtho­nous或indigenous);而不能在健康昆虫肠道内长期生存的微生物为过路微生物群落（allochthonous或transient)。有些过路微生物对昆虫具有致病作用，如苏云金杆菌（SaciZZust/mciTigieTisis)、嗜线虫致病杆屬（Xenorhabdusnematophila')、发光杆屬（.Photorhab-(iusZumiyiesceyis)等是病原菌（pathogen);而能够保护寄主、抵御疾病的微生物是益生菌（probiotics)[9]。有些肠道微生物能够与昆虫互利共生则为共生菌[1°_]，包括兼性共生菌和专性共生菌，兼性共生菌通常可以体外培养[12_13]，离开昆虫对昆虫没有影响或影响很小；但昆虫在缺少专性共生菌的情况下两者均无法存活[14]。有些肠道微生物会对昆虫的生长发育造成明显影响，甚至可能导致寄主死亡，这类微生物为寄生菌。2昆虫肠道微生物多样性检测方法2.1传统培养检测方法传统培养检测方法是在分离培养昆虫肠道微生物的基础上，根据菌株形态和生理生化特征进行鉴定检测[15]。这种方法需要体外培养昆虫肠道微生物，目前可用于检测昆虫肠道微生物的培养基包括牛肉膏蛋白胨（NA)培养基、LB培养基、克氏双糖铁琼脂（KIA)培养基、三糖铁琼脂（TSI)培养基、赖氨酸铁琼脂（LIA)培养基、不发酵革兰阴性杆菌初筛鉴定培养基、柠檬酸盐甘露醇琼脂培养基、气单胞菌初筛鉴定培养基等。由于培养方法、培养基成分和技术的限制，很多昆虫肠道微生物无法体外培养[1647]，因此传统培养检测鉴定方法得到的信息十分有限。2.2基于16SrRNA基因的分子检测方法16SrRNA是原核细胞核糖体30S小亚基的组成部分，其编码基因存在于所有细菌的基因组中。16SrRNA基因具有高度的保守性和特异性，基因片段长度比较适宜，碱基排列顺序复杂度适中，可用通用PCR引物或探针对特定微生物进行种类鉴定，由于其具有9个可变区，也可设计一些特异性的引物和探针，进行某些特定细菌属、种的鉴定[18_19]。16SrRNA基因序列法基于不同微生物种类核酸组成上的差异，通过采用某些引物扩增差异基因或直接对核酸进行测序，将所获得的核酸序列与一些基因数据库中的已知序列进行比对，进而分析不同微生物之间的相互关系。由于16SrRNA基因检测技术序列测定和分析比对操作相对简单，已成为昆虫肠道微生物检测和鉴定的一种强有力工具[2°]。2.3基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序检测方法焦磷酸测序法是依靠生物发光对DNA序列进行检测的方法[21_22]。超高通量基因组测序系统GS-FLX能够在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号释放的有无和强度，可实时测定DNA序列。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点[23_25]。利用基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统能够得到大量的表达序列标签（EST)，通过对这些EST序列与已知数据库进行生物信息学分析比较，能够全面了解和分析昆虫肠道微生物的多样性。2.4基于宏基因组学的检测方法宏基因组学（metagenomics)也称为兀基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科[26_27]。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从环境样品中提取全部微生物，或通过测序探究环境中微生物的群落结构和功能（序列驱动），或构建宏基因组文库，从而筛选新的基因或生物活性物质（功能驱动）。这种方法克服了传统培养方法的缺陷，极大地丰富了人们对微生物多样性及其功能的认知[28]。高通量测序技术和基因芯片技术是宏基因组技术中的2类关键技术。测序技术可以发现新物种和新基因，但由于测序深度有限、定量性差，不易发现低丰度物种且易受污染物干扰；芯片技术很好地克服了这些局限，但不易于发现新基因，将2类技术结合起来的综合研究越来越多[29]。通过采用宏基因组技术，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及其与环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围，也为昆虫肠道微生物多样性研究提供了新方法。2.5基于DGGE指纹图谱技术的检测方法DGGE(变性梯度凝胶电泳）指纹图谱技术是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开的一种技术。这种技第11期鲁迎新等：昆虫肠道微生物多样性研究进展3术能将同样大小的DNA片段很好地分开，是一种有效的分子标记方法。DGGE指纹图谱技术具有突变检出率高、操作简便、快速、重复性好等优点，还能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成，现已广泛应用于生物多样性调查等多个领域[3°_33]。3昆虫肠道微生物多样性研究概况3.1家蚕肠道微生物的多样性家蚕TTiGrf)是重要的经济昆虫和模式昆虫，其肠道中的微生物种类、数量不仅影响蚕体对营养物质的吸收与转化，而且影响蚕体的健康[34_35]。袁志辉等M采用非培养法和传统培养法相结合的方法，对家蚕5龄幼虫肠道微生物进行了调查和分析，发现家蚕的肠道细菌在分类上主要属于节杆菌属（)、乳杆菌属（Zws)、假单胞菌属（)、埃希氏菌属（E'sc/i-erfc/zid)、微球菌属（Micrococcz^)、芽抱杆菌属（ZziS)和葡萄球菌属（S_/iyZGCGCCWS)，它们在家蚕生长发育中起着重要的作用，尤其是在消化利用桑叶和疾病的预防中凸显优势。田贞华等[36]采用普通培养基和稀释培养基从家蚕4龄第3天幼虫的中肠内容物分离出109株细菌，属于芽孢杆菌属、节杆菌属、肠杆菌属（£^ero6ac?er)、微杆菌属（Micro6ac?erf-WTTi)、葡萄球菌属、短杆菌属（)、纤维S(Cellulosimicrobium){Enterococ-cz/s)、短状杆菌属（_6mc/iy6c^e“7?i)、棒状杆菌属()，揭7K了家香肠道细菌种群的多样性；而2种培养基相比，稀释培养基能分离出更多的微生物[37_38]。蚕的性别、龄期和不同饲料喂养都会对蚕的肠道微生物种类造成影响。相辉等[39]采用〇00£和16SrDNA文库序列分析的方法，研究发现不同发育阶段幼虫的肠道细菌组成存在差异，家蚕肠道特殊菌群的出现可能与食性有关系，饲料改变会引起肠道微生态平衡发生变化。向芸庆等[4°]以不同的桑科植物（柘叶与桑叶）分别饲养家蚕洞庭x碧波杂交种，采用纯培养分离检测技术和16SrDNA序列测定及系统发育分析方法，对家蚕4、5龄幼虫肠道优势菌群的类型进行了鉴定和差异性分析，发现柘叶与桑叶饲养的家蚕中肠均具有以下4个优势菌群:短波单胞杆菌属、寡养单胞菌属（SfcTioftDp/