3-1-蛋白质分子设计

第三章蛋白质结构改造主要内容•第一节蛋白质分子设计•第二节蛋白质的化学修饰•第三节蛋白质的分子生物学改造第一节蛋白质的分子设计分子生物学最激动人心的进展之一是能够设计和生产新型的蛋白质分子。重组DNA技术使人们能够定向改变蛋白质中的氨基酸序列，包括氨基酸的取代、插入或缺失，甚至包括蛋白质的融合等。蛋白质工程是在深入了解蛋白质结构与功能关系的基础上，利用化学和分子生物学方法有目的地改造蛋白质，使之性能得到改善。作为蛋白质工程的组成部分，蛋白质分子设计在其中起着十分重要的作用。•先讲理论•后面举几个例子蛋白质分子设计策略•理性设计策略–前提:充分了解结构与功能的关系•随机突变+功能筛选–前提:不了解结构与功能的关系•理性设计+随机突变+功能筛选–前提:不完全了解结构与功能的关系分子设计的种类小改：少数残基的替换，突变或修饰中改：分子拼接，肽段或结构域的替换大改：从头设计，全新蛋白质的设计蛋白质分子设计考虑的因素1.氨基酸2.肽链特性3.蛋白质构象的特点4.蛋白质分子间的作用5.蛋白质分子内的作用氨基酸的性质电荷酸碱性亲水性、疏水性多肽链的酰胺平面是刚性的，但酰胺平面之间的相对位置可以变化。C-N-Ca-CN-Ca-C-N肽链的特性蛋白质分子的相互作用蛋白质-蛋白质相互作用类别酶-底物相互作用受体-配体相互作用抗原-抗体相互作用蛋白质-蛋白质相互作用力氢键静电作用范德华作用氢键强极性原子上的氢原子与带负电荷的原子的作用。作用距离一般在3Å以内。Arg的胍基、Lys的氨基Asp、Glu的羧基4Å之内强静电作用4-8Å为弱静电作用静电作用----异性带电基团的作用范德华作用所有距离在4Å之内的原子之间的作用非极性基团之间的作用距离在4Å之内（疏水作用）蛋白质分子设计的应用1.酶稳定性的改善2.药物设计3.抗体分子的人源化设计4.蛋白质分子的模拟肽设计5.蛋白质分子改造6.蛋白质的从头设计酶稳定性的改善酶的稳定性。在蛋白质工程的实践中，一般可以通过在酶分子内增强分子内的作用（增加二硫键或静电作用）来提高酶分子的稳定性。药物设计三个层次：一是小分子化合物的药物设计。二是多肽分子的药物设计，通过研究多肽分子与受体的相互作用情况来进行分子设计。第三种情况是蛋白质大分子的药物设计，主要是设计能够改变蛋白质天然性能的新型突变体。基于结构的药物设计确定靶蛋白的结合口袋，以结合口袋的结构环境设计药物；未知受体结构时，根据具有相同或相似生物学活性的已知化合物的结构叠合，反推受体结合口袋的可能结构环境，根据推测的受体结合口袋进行新型药物设计。蛋白质分子的模拟肽设计骨架残基设计，肽库筛选以结构为模板的分子设计。抗体分子的人源化设计抗体分子在导向药物和很多疾病的治疗中有明显优势，但一般人们目前研究较多的鼠源性抗体，它们在人体中会产生免疫反应。消除鼠源性抗体的免疫原性，使其人源化，是目前抗体工程领域重要的研究方向。蛋白质分子改造突变体设计融合蛋白设计•我们关心的蛋白质属性:活性、稳定性、特异性、免疫原性、半衰期、功能分解或组合、聚合性质等蛋白质的从头设计从头设计是指从蛋白质的一级序列出发，按照研究者的意愿，设计和制造出自然界不存在的、具有特定的空间结构和生物学功能的全新蛋白质。蛋白质分子设计的原则活性设计:活性中心,催化部位对专一性的设计:底物结合部位框架设计:蛋白质分子的立体结构设计疏水基团与亲水基团的合理分布氨基酸侧链几何排列为提高一种性能而进行的结构改造对其他结构/性能的影响最小蛋白质分子设计的实例之一目标:核糖核酸酶的热稳定性的提高已知条件：核糖核酸酶三维结构已由晶体衍射方法测定。分子内有两对二硫键酶的活性中心已经确定结构分析得到的信息：Tyr24与Asn84正对，二者的Ca之间的距离为6.0A，满足二硫键的特征（二硫键的Ca的平均距离：4.5-6.8A），可能形成一个潜在的二硫键。二者附近没有干扰形成二硫键的基团。二者离催化活性中心较远，突变后不会影响活性。设计方案：将Tyr24与Asn84突变为Cys实验结果：突变体的稳定性大大提高突变体:55℃70%活性野生型:55℃10%活性蛋白质分子设计的实例之二可溶的干扰素突变体的设计面临的问题干扰素是一种重要的治疗药物。在大肠杆菌中表达较难溶解，造成纯化和生产的困难能否通过蛋白质工程的办法,提高其水溶性?解决方法利用鼠的干扰素的晶体结构预测了人的干扰素的空间结构。根据模建的人干扰素的三维结构，计算分子表面，确定了表面暴露的残基。根据文献报道，知道了人干扰素的功能残基。选择了5个远离功能残基的、位于表面的苯丙氨酸和亮氨酸(疏水氨基酸)，突变为丝氨酸(级性氨基酸,亲水)。实验结果设计的人的干扰素突变体的表达量大大提高，占到了总蛋白的10%。蛋白质分子设计的实例之三具有受体特异性的肿瘤坏死因子突变体的设计肿瘤坏死因子具有明显的特性：杀死肿瘤细胞√毒副作用×与淋巴毒素共用两个受体：R55R75肿瘤坏死因子的蛋白质工程改造的目标：制备具有杀死肿瘤细胞，但毒副作用小的新型TNF突变体或模拟肽。问题：TNF的不同生物学功能是否由不同受体介导？方向：制造出具有受体特异性的突变体是研究TNF功能的重要途径。已知信息：肿瘤坏死因子的晶体结构淋巴毒素与R55的复合物晶体结构分子设计目的：设计出对R55R75两种受体具有选择性的TNF突变体。设计思路：模拟肿瘤坏死因子与两种受体的相互作用情况，确定特异作用残基，进行突变。具体方法：利用R55受体的结构模建R75受体的结构根据淋巴毒素与R55的作用情况，模拟肿瘤坏死因子与R55受体的相互作用情况。根据肿瘤坏死因子与R55受体的相互作用情况，模拟肿瘤坏死因子与R75受体的相互作用情况。Gln67与R55作用不明显，但与R75的Asp有静电作用，将它突变为结构相似但带电相反的Glu会降低TNF与R75的作用，但不会改变与R55的作用。模拟结果：Glu53与R55的残基有静电作用，而与R75没有明显的作用，故将Glu53突变为带正电荷的残基，会降低与R55的作用，而不会对TNF与R75的作用有影响。分子设计---突变位点确定R55受体特异性TNF突变体设计Q(Gln)67E(Glu)可望减弱TNF与R75受体的吸引作用，但与R55受体的作用力不会减弱R75受体特异性TNF突变体设计E(Glu)53R(Arg)可望减弱TNF与R55受体的吸引作用，但与R75受体的作用力不会减弱实验结果：突变体Q67E选择结合R55受体突变体E53R选择结合R75受体蛋白质分子设计的程序1.收集相关蛋白质的结构信息2.建立所研究蛋白质的结构模型3.结构模型的生物信息学分析4.选择设计目标5.序列设计6.预测结果7.获得新蛋白质8.新蛋白质的检验9.反复设计,最后完成蛋白质设计四、TGFα3-mSEA融合蛋白连接肽长度的设计金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）是一种具有超抗原活性的细菌毒素，将TGFα(Transforminggrowthfactor)的第三环区与SEA进行融合，将有可能实现超抗原对EGFR高表达肿瘤细胞的靶向治疗。•融合蛋白中连接肽的长度对融合蛋白的功能活性有很大的影响。确定合适的连接肽的长度非常重要。选择了两种TGFα3-mSEA融合蛋白进行结构模建：mTSA含长连接肽（8肽）的TGFα3-mSEAmTSB含短连接肽（5肽）的TGFα3-mSEA然后通过对两种融合蛋白结构的比较来确定连接肽长度。•模建策略：•根据我们的方法，拟采取以下步骤：1、搭建整体结构（连接肽自动生成）2、优化连接肽（控制SEA及TGFα3的结构）3、融合蛋白分子的整体优化重点放在优化结构方面•模建过程：•以SEA的结构作为模板，模建融合蛋白中SEA，连接肽作为loop用分子力学手段直接生成，TGFα3的结构根据TGFα的NMR结构直接拷贝。•结构的优化：•固定融合蛋白质中的SEA及TGFα3部分的结构，只对连接肽进行优化，优化至能量收敛，得到能量优势构象。•进行融合蛋白分子的整体的结构优化至能量收敛，最终的能量优势构象作为融合蛋白的结构。mTSA（连接肽为8肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）空间结构mTSB（连接区为5肽的TGFα3-mSEA融合蛋白）的空间结构TGFα3-mSEA分子中SEA与天然SEA结构的比较TGFα3-mSEA分子中TGFα3与天然TGFα结构的比较CAbackboneHeavymTSA0.31Å0.39Å3.13ÅmTSB0.41Å0.50Å3.60ÅCAbackbonemTSA0.79Å0.89ÅmTSB0.79Å0.92Å•根据结构模建得到的结论：•TGFα3-mSEA融合蛋白中的连接肽为5个氨基酸时，对TGFα3和SEA影响较大，8个氨基酸的linker对两者空间构象影响较小。•推论：8个氨基酸的linker对功能影响小。实验验证：•融合蛋白的表达、纯化、活性测定工作由胥全彬博士完成。•实验结果：•融合蛋白与脾细胞共培养，mTSA（8肽的linkerTGFα3-mSEA融合蛋白）比mTSB（5肽的linkerTGFα3-mSEA融合蛋白）更能显著促进脾细胞的增殖。•受体特异性结合试验及激光共聚焦分析表明，融合蛋白mTSA能特异性地结合到A431的EGF受体。不同蛋白刺激脾细胞增殖活性试验00.10.20.30.40.50.60.70.8SEArSEAmTSAmTSBmSTPHABlankOD570CADBmTSA与A431细胞结合的特异性试验A.PositivecontrolEGF;B.pmTSA;C.mTSAbindingblockedbyEGF;D.Blankcontrol:PBS00.10.20.30.40.50.60.70.80.90.020.2220200Protein(ng)OD570mTSABSASEA融合蛋白与A431细胞结合的剂量曲线五、KGDW-尿激酶原嵌合体中KGDW插入位置的确定•引言：在尿激酶原分子中插入KGDW功能小肽，可能构建出同时具有溶栓和抗栓性能的多功能溶栓剂。•但是在蛋白质分子中引入一段肽后会引起原有结构的改变，而且在不同的位置插入对结构改变的影响大小不同，为了保证嵌合体的溶栓和抗栓性能，必须在尿激酶原分子中寻找插入小肽的合适位置。•研究思路：•分析尿激酶原分子的结构，寻找可能的插入位置。•模建尿激酶原分子中的不同位置插入KGDW嵌合体的空间结构。•嵌合体与尿激酶原的空间结构比较。•方法：•根据天然尿激酶原的分子结构特点，模建了两种KGDW-尿激酶原分子嵌合体的空间结构：•嵌合体1：在118-119之间插入KGDW•嵌合体2：在126-127之间插入KGDW•嵌合体空间结构的模建策略：•因为嵌合体的特点是在一个较大的分子中插入了几个氨基酸，所以可以采用以下办法：即以尿激酶原的结构为模板，直接模建嵌合体KGDW-尿激酶原的结构，然后直接进行整个嵌合体结构的优化。优化采用Modeler的有关程序进行。嵌合体与尿激酶原的结构比较•根据模建结果得到的结论：•嵌合体1的结构与天然尿激酶原的结构接近，仍然具有溶栓活性，可能成为理想的双功能分子。RMS（Å）CABackbone嵌合体10.901.01嵌合体22.642.65•实验验证：•实验工作全部由博士后井健（现北京师范大学副教授）完成•经过纤维平板溶解圈法试验表明，设计的KGDW-尿激酶原嵌合体仍然具有较强的溶栓活性；小板聚集实验表明KGDW-尿激酶原嵌合体具有较强的血小板聚集抑制活性。fibrinolyticspecificactivitydeterminationofKGDW-proUKmutantchimera.StandardproUK:1IU,2IU,0.5IU,2IU;KGDW-proUK:10ulafterdilutionprocedure.天然尿激酶原的活性：100,000-120,000IU/mgKGDW-proUK嵌合体