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e7-2人工合成核酸的基本步骤(一)起始原料的制备1.核苷酸的来源合成所需要的核苷酸单体可以从某些生物中制备(如鲑鱼的精子),也可以通过化学合成得到。2.核苷的保护一般使用二甲氧基三苯基(dimethoxytritylgroup,DMT)对核糖或脱氧核糖的5′-羟基进行保护,用脂酰基(acyl)对碱基上的氨基进行保护。如苯甲酰基(benzoyl,Bz)对A或C上的氨基进行保护,异丁酰基(isobutyryl)对G上氨基的保护[图e7-1(1)和图e7-1(2)]。如果要合成RNA,还需要使用氰乙基(cyanoethyl)对2′-羟基进行保护。图e7-1(1)核苷酸的制备、保护和3′-羟基的活化保护基团所起的作用是,既能防止反应发生在不该发生的位置,还能增加核苷酸在有机溶剂中的溶解性。图e7-1(2)碱基的保护DMT对5′-羟基的保护是暂时的,在合成中需要使用酸处理的方法将其除去,以便让后面的偶联反应得以进行。由于为碱基上的氨基提供保护的脂酰基对酸很稳定,因此,在合成中可以保留不变,只需在最后一步去保护反应中使用氨水处理即可。3.磷酸化或亚磷酸化这一步的目的是在3′-羟基加上反应性磷基团。磷可以是五价的(磷酸),也可以是三价的(亚磷酸),但三价磷的反应性更强。(二)偶联反应这一步反应的目的是让核苷酸之间只能通过3′,5′-磷酸二酯键连接起来。保护基团的存在致使反应只能发生在3′-磷酸和5′-自由的羟基之间,而不会产生5′,5′-连接或3′,3′-连接或分子内的连接[图e7-1(3)]。这样的偶联反应可按3′→5′方向循环多次,一直合成到所需要的长度为止。(三)去保护这一步反应是为了去除留在碱基上和3′,5′-连接上的(如果是RNA还包括2′-羟基)保护性基团,从而产生真正的单链DNA或RNA。核酸的化学合成一般都使用固相合成法,并已实现了自动化(参看第四章蛋白质的性质及研究方法中多肽的固相合成)。图e7-1(3)核苷酸之间的偶联反应
本文标题:e-7-2人工合成核酸的基本步骤
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