细胞因子检测方法

细胞因子检测方法基础医学院微免学系王慧娟背景细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等（一）依赖性细胞株：生物分析法（二）功能检测：生物分析法（三）免疫测定：免疫分析法（四）功能测定与抗体抑制（五）分子杂交技术：mRNA的测定（六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定生物分析法（一）依赖性细胞株一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。（二）功能检测利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素的影响。免疫分析法（1）放免实验（RIA）（2）酶联免疫吸附实验（ELISA）mRNA的测定（1）分子杂交实验（2）逆转录PCR（RT-PCR）小结生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。影响因素原理与方法灵敏度准确度和特异性精密度：免疫分析法的精密度较其生物分析法有较大提高；批内变异通常为20%～25%，因此有必要进行2次或3次检测标准化生物分析法和免疫分析法结合使用免疫分析法ELISA细胞内细胞因子的流式细胞仪检测ELISPOTELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay1．间接ELISA（IndirectELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。2．夹心ELISA（SandwichELISA）：用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。3．竞争ELISA（CompetitiveELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。夹心ELISA第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加入标准品或者标本第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光议读取结果（OD：opticaldensity）第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含量注意事项实验前：确定试剂盒在有效期内仔细阅读说明书按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）根据检测标本数量确定所需试剂的量按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂注意事项标本的制备和贮存：血清、血浆标本：尽快分装，贮存在-70℃，避免反复冻融。使用前将标本平衡至室温，不能用水浴锅细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞和细胞残渣。注意事项试剂盒贮存条件和有效期未开封试剂盒：贮存在2-8℃开封/复溶试剂：2-8℃可以1个月左右标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避免反复冻融微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右检测方法的进展高通量细胞因子检测CBA(CytometricBeadArray)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。夹心ELISA缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一性和频率性的直接信息细胞内细胞因子的免疫荧光检测ELISPOT原位杂交单一细胞PCR细胞内细胞因子的流式细胞仪检测原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积，增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。细胞内细胞因子的流式细胞仪检测方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。特点：快速简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群；接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。所需仪器流式细胞仪所需试剂１．细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂２．荧光标记的细胞因子抗体３．激活剂：①Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)②Ionomycin③StaphylococcalenterotoxinB(SEB)４．蛋白转运抑制剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力①Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活过程最后4-5小时使用BFA，过度孵育会导致细胞活力下降②Monensin：3uM所需试剂５．固定剂：含4%的多聚甲醛PBS溶液细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。６．破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合细胞培养和刺激的基本方法人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小时人TNF-α：使用PMA(50ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激６小时人IL-2：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小时小鼠IL-2：细胞在包被抗小鼠CD3抗体(25ug/ml)的培养板中，使用抗CD28抗体(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)刺激6小时基本过程（以全血为例）１、收获细胞２、阻断Fc受体：消除非特异性的结合染色３、细胞表面染色４、固定和破膜５、细胞内染色免疫分析法ELISA细胞内细胞因子的流式细胞仪检测ELISPOTELISPOTEnzyme-linkedImmunospotAssayELISPOT发展历史1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。1983年：Czerkinsky等成功地检测出因受刺激而分泌抗体的B细胞频率接近体内实验的环境，藉由检测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者PrecursorT亚群的大小，预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。1996：俄亥俄卅CaseWesternReserve大学PaulLehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuberetal.,Science,1996），解决了低敏感度的问题。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)自动分析TNF-α酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽的靶细胞接触后PBMC中抗原特异性CD8+T细胞的数量Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于100时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过显微镜或ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT标准操作程序D1ELISPOT包被程序每孔加入15μl70%的乙醇预湿30秒，PVDF膜变成半透明状（加样注意！）加入100μl去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留每孔加入100μl包被抗体工作液，4°C包被过夜ELISPOT标准操作程序D2倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。）ELISPOT标准操作程序D2铺细胞,加入刺激物，培养正对照（PHA刺激）10μl，终浓度4ug/mL样品负对照（不加刺激物）背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）：100μl的U-Cytech无血清培养基设置2-4个孔的重复ELISPOT标准操作程序D2以前做的封闭，可加入200μl的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次加入不同浓度的细胞，100μl/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀加入刺激物（配制成10X终浓度，10μl/well）到实验孔不要再震动或者拍击ELISPOT板盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24hr在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。避免开关培养箱的箱门！ELISPOT标准操作程序D3培养后操作倾倒孔内的细胞及培养基，低渗法将细胞裂解：每孔加200μl冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟200μl的PBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C1小时200μl的PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干ELISPOT标准操作程序D3在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。（注意：一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜！）ELISPOT标准操作程序D3稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μl，37°C1小时200μl的PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干解冻已配好的显色液，每孔加入100μl的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。ELISPOT标准操作程序D3待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂!ELISPPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计