异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型

异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响季平何家禄农业部家蚕生物技术重点开放实验室中国农业科学院蚕业研究所镇江摘要将°∂的πολη基因克隆到缺失πολη基因的°∂°基因组中得到被°∂多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒°∂2°∀发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫∀关键词家蚕核型多角体病毒异源多角体蛋白基因包埋型病毒经口感染°≤检测中图分类号≥文献标识码文章编号222ΙνφεχτιϖιτψοφτηεΡεχομβιναντΒομβψξμοριΝυχλεαρΠολψηεδροσισςιρυσΧονταινινγΗετερογενεουσΠολψηεδριν°∞2∏ΚεψΛαβορατορψοφΣιλκωορμΒιοτεχηνολογψΜινιστρψοφΑγριχυλτυρεΣεριχυλτυραλΡεσεαρχηΙνστιτυτεΧηινεσεΑχαδεμψοφΑγριχυλτυραλΣχιενχεσΖηενϕιανγ212018Αβστραχτ×ποληΑυτογραπηαχαλιφορνιχα∏∏√∏°∂°∂°Βομβψξμορι∏√∏°∂°°∂2°×√∏∏°∂¬×∏√∏°∂2°√∏περοσ∏∏√∏∏√περοσ∏°∂ΚεψωορδσΒομβψξμορι∏√∏°∂∏∏√∏Περοσ∏°≤收稿日期22基金项目国家自然科学基金资助项目江苏省科委科技发展计划作者简介季平2男江苏南通人博士助理研究员主要从事杆状病毒分子生物学研究∀何家禄为本文联系人×2ƒ¬2∞2∏家蚕核型多角体病毒Βομβψξμορι∏√∏°∂与同属的苜蓿尺蠖核型多角体病毒Αυτογραπηαχαλιφορνιχα∏2∏√∏°∂的生物学特性非常相似核型多角体病毒的整个发育过程中可形成芽生型病毒∂和包埋型病毒∂粒子∀∂负责细胞和组织之间的传播而∂则负责昆虫个体之间的传播两种表型的病毒粒子基因组是相同的但在形态结构!囊膜蛋白组成!感染组织专一性和侵入宿主细胞的方式上都有所不同≈∀°∂和°∂基因组中基因的排列方式很相似基因同源性在以上有的甚至高达≈但各有不同的宿主域不能交叉感染∀°∂主要感染家蚕!野蚕!蓖麻蚕等少数几种昆虫而°∂可以感染粉纹夜蛾!甜菜行军虫!盐沼灯蛾!玉米夜蛾!棉潜蛾和小菜蛾等多种农林害中国农业科学≥∏∏≥虫≈∀近年来通过对°∂基因组解链酶基因的改造可以有效解决宿主域问题≈为利用家蚕作替代宿主生产基因工程杀虫剂提供了新的思路然而人们忧虑其对蚕桑生产的安全性∀本试验采用反向筛选获得含°∂多角体蛋白基因的重组°∂≈即°∂2°并研究了该病毒的感染特性∀材料与方法材料质粒与菌株质粒≥°中含有慈菇蛋白酶抑制剂基因由中国科学院上海生物化学研究所戚正武教授馈赠杆状病毒转移载体和大肠杆菌×由本实验室保存载体是在°的∞∂位点处反向插入°∂的πολη及其启动子另一个πολη的启动子用于启动外源基因的表达同源重组区为°∂的πολη的和端侧翼序列∀病毒!细胞和家蚕幼虫野生型°∂2株由本实验室保存°∂°≈即°∂由前文构建≈∗∀细胞用含ƒ≥的×≤2ε培养∀家蚕品种≠由本实验室提供∀试验方法基因克隆参照文献≈进行∀重组病毒的构建参照文献≈进行∀芽生病毒在细胞内的增殖°∂和°∂2°病毒扩增液离心后各取Λ芽生病毒液分别接种等量的贴壁培养细胞在感染后!!!和分别取样空斑法测定芽生病毒滴度作病毒增殖曲线∀在病毒感染后收集病毒感染细胞提取多角体病毒颗粒血球计数板进行计数∀芽生病毒在家蚕幼虫体内的增殖各取Λ的°∂和°∂2°芽生病毒约≅∏分别注射感染龄第天的家蚕幼虫在感染后!!!和的血淋巴按文献≈进行≥⁄≥2°∞分析从外源蛋白表达方面考察病毒的增殖情况∀包埋型病毒的口服试验桑叶分别浸泡在≅°Ù的°∂和≅°Ù的°∂2°的包埋型病毒液中后取出晾干另设清水处理作对照把龄起蚕分成区每区头设个重复然后用处理后的桑叶喂养后改用正常桑叶ε饲养调查蚕的发病情况∀°≤检测龄起蚕区每区头分别滴喂°∂和°∂2°包埋型病毒≅°Ù蚕正常饲养分别收集∗的蚕粪和后各条蚕的血淋巴提取∂或∂病毒⁄用°∂基因组中≥⁄基因的和端引物≈作°≤扩增判定病毒感染与否∀结果与分析ΒμΝΠς和ΑχΜΝΠς多角体蛋白的氨基酸组成°∂序列≈与°∂序列≈其同源性仅为远低于病毒基因组中的其它基因≈∀比较编码的氨基酸肽链一级结构多角体蛋白的氨基酸都是个但其中个氨基酸发生变异有个氨基酸涉及电荷变化°∂比°∂多出个°少个≤而且这两者变异的氨基酸中极性差异很大这些氨基酸都与多角体蛋白的空间构象有密切关系∀重组病毒ΒμΝΠςΟΑχ2ΑΠΙ的构建将≥°中的慈菇蛋白酶抑制剂基因正确克隆到转移载体中得到重组转移载体°与°∂°基因组⁄共转染细胞经过两轮筛选得到含多角体的重组病毒°∂2°图该重组病毒的多角体蛋白是由°∂的表达而来∀病毒在ΒμΝ细胞内的增殖°∂2°的∂感染细胞后细胞停止分裂出现典型的病毒感染症状∀病毒增殖滴度的测定表明其增殖曲线与对照°∂的相似∀收集感染后细胞计数多角体≅细胞中产生≅个多角体对照产生的°∂多角体为≅是前者的左右∀病毒在家蚕幼虫体内的增殖将°∂2°和°∂的∂分别注射龄饷食后的家蚕幼虫剂量为≅∏Ù蚕∀饲养两种病毒感染的家蚕幼虫都出现典型的发病症状随后陆续死亡∀对病毒不同感染时期的血淋巴进行≥⁄≥2°∞电泳分析∀发现°∂2°感染后的血淋巴中已有外源基因的表达的°表达量昀高出现明显的∏条带图证明°∂2°能在蚕体内增殖∀中国农业科学卷图重组病毒ΒμΝΠςΟΑχ2ΑΠΙ的构建ƒ≤∏°∂2°包埋型病毒粒子的口服感染添食∂的龄家蚕添食后°∂2°和正常区的家蚕已陆续就眠而°∂区的家蚕幼虫有的个体已经死亡其余蚕不能正常入眠在死亡率达°∂区家蚕幼虫全部死亡∀而此时的°∂2°和清水正常对照区的家蚕已进入龄存活率为并顺利进入龄没有出现任何的发病症状∀∗°∂感染后!!!血淋巴∏分子量标准∗°∂2感染后!!!血淋巴∗°∂∏∏∗°∂2°图ΒμΝΠςΟΑχ2ΑΠΙ芽生病毒注射感染家蚕幼虫血淋巴的ΣΔΣ2ΠΑΓΕ分析ƒ×≥⁄≥2°∞∏√∏°∂2°ΠΧΡ鉴定病毒的感染性对添食°∂2°∂的家蚕排泄物和血淋巴进行°≤检测发现在添食后∗收集的蚕粪中能扩增出的≥⁄基因片段但在添食后和的家蚕血淋巴中都不能扩增出该片段∀添食°∂∂的蚕体血淋巴中都能扩增出该基因片段图∀和Κ⁄Ù®分子量标准°∂正常蚕血°∂2°蚕粪°∂蚕粪°∂后蚕血°∂2°蚕血°∂后蚕血°∂2°后蚕血Κ⁄Ù®°∂√°∂2°√°∂√°∂√°∂2°√°∂√°∂2°√图添食ΒμΝΠς或ΒμΝΠςΟΑχ2ΑΠΙ后的ΠΧΡ扩增产物的凝胶电泳ƒ×°≤∏περοσ°∂°∂2°期季平等异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响讨论°∂通常是以经口感染控制宿主昆虫的种群密度∀经口感染时°∂的多角体蛋白不可缺少不形成多角体包埋的重组病毒难予经口感染在基因工程杆状病毒杀虫剂的研制过程中必须保留πολη∀我们采用异源包装的方法把°∂的πολη引入到不含家蚕πολη的°∂°基因组中构建了既产生°∂多角体蛋白包埋的重组核型多角体病毒又能表达慈菇蛋白酶抑制剂的°∂2°∀通过感染性分析发现该重组病毒的芽生型病毒∂能感染家蚕细胞和经皮下注射的家蚕幼虫但包埋型病毒∂不能经口感染∀推测引起这一现象的主要原因是由于该病毒被°∂的多角体蛋白所包埋°∂与°∂的多角体蛋白氨基酸组成差异较大蛋白空间构型不同不同种类的多角体蛋白可能会影响其在肠液中的溶解性影响肠围食膜的通透性或病毒与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合∀本试验表明能防止重组°∂经口感染家蚕不会因田间释放而影响蚕桑生产这可能为利用家蚕作替代宿主生产安全高效的重组杆状病毒杀虫剂提供一条新途径进一步的研究在进行中∀Ρεφερενχεσ≈∏≥∂∏∂≈≥°≤吕鸿声昆虫病毒与昆虫病毒病≈北京科学出版社≈≥∏≤∞≠•⁄∏¬∏∏√∏°∂≈1∂≈≥≥¬Αυτογραπηαχαλιφορνιχα∏√∏°∂22⁄Βομβψξμορι°∂≈∂≈∏≤2×∏2Αυτογραπηαχαλιφορνιχα∏√∏∏Βομβψξμορι√≈∂≈°ƒ°∏√≈≥≥≤季平张志芳何家禄等1利用家蚕生产慈菇蛋白酶抑制剂≈1蚕业科学≈°ƒ∞¬°√∏≈≥≤季平张志芳何家禄等慈菇蛋白酶抑制剂基因在家蚕幼虫和蛹体中的表达≈生物化学与生物物理学报≈°÷±∞¬∏∏√≈≤∏≤季平肖庆利何家禄等融合信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕内表达≈生物工程学报≈≥ƒ∞ƒ×∏∏≈≠≤≥≈••°•∏≥∏≥⁄¬∏√∏¬∞≈≥≤王文兵季平吴峻等家蚕°∂≥⁄基因序列和在大肠杆菌中表达≈生物化学与生物物理学报≈∏××∏∏¬∏√∏≈≥≤周金涛甘人宝李敏棠等家蚕核多角体病毒多角体蛋白基因的核苷酸序列≈生物化学与生物物理学报≈⁄≥≤∏×⁄∏Αυτογραπηαχαλιφορνιχα∏√∏≈∂≈⁄√∏√∏εγτ≈Ù×中国农业科学卷