牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

生物工程学报ChinJBiotech2009,August25;25(8):1160-11[e-mail]©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:April20,2009;Accepted:June18,2009Supportedby:NationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863Program)(No.2006AA10Z306),JilinProvinceScienceandTechnologyDevelopmentPlan(Nos.20060219,20080228).Correspondingauthor:ZhennaiYang.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2006AA10Z306),吉林省科技发展计划项目(Nos.20060219,20080228),现代农业产业技术体系建设专项资金(农科教发[2007]14号)资助。食品生物技术牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达张莉,姜媛媛,张健,杨贞耐中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心,长春130033摘要:通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。关键词:牛凝乳酶,分泌表达,毕赤酵母RecombinantexpressionofbovinechymosininPichiapastorisLiZhang,YuanyuanJiang,JianZhang,andZhennaiYangCenterofAgro-foodTechnology,NortheastAgriculturalResearchCenterofChina,Changchun130033,ChinaAbstract:Toexpressbovinechymosininyeast,weamplifiedtheprochymosingenefromtheplasmidpMD18T-ProchybyPCR,andthenclonedthegeneintotheexpressionvectorpPICZaA,resultinginpPICZaA-Prochy.PichiapastorisGS115wasusedashostcells.IntegrationoftheprochymosincDNAintothePichiapastorisgenomewasconfirmedbyPCRandsequencinganalysis.ChymosinwasexpressedinPichiapastorissuccessfully,andastrongbandatabout37kDwasshownbySDS-PAGE.Activitytestsshowedthatthechymosinactivityoftheculturesupernatantwas12.2SU/mL.ThisisthefirstreportofsuccessfulexpressionofchymosininPichiapastoris.TherecombinantPichiapastorisstrainobtainedinthisstudycouldbefurtherusedtoproducerecombinantchymosinforcheesemaking.Keywords:bovinechymosin,secretoryexpression,Pichiapastoris凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶,它可以切断牛乳中的-酪蛋白使乳凝固。在小牛皱胃中,凝乳酶通常合成为一个含有381个氨基酸的前体聚肽——凝乳酶原前体,凝乳酶原前体在分泌过程中去掉16个信号肽形成含有365个氨基酸的凝乳酶原。凝乳酶原无活性,它在酸性pH下通过多步的自动催化过程,去掉N末端42个氨基酸形成有活性的含有323个氨基酸的蛋白——凝乳张莉等:牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达1161Journals.im.ac.cn酶[1]。凝乳酶主要的生物学功能是水解牛乳中-酪蛋白的Phe105-Met106键,导致牛乳凝结,因此被广泛用于干酪制造业。传统的凝乳酶通过宰杀未断奶小牛从皱胃中提取。目前世界年均约5000万头小牛被宰杀供提取凝乳酶,由于全球性的小牛短缺使其来源变得不稳定,这种传统而昂贵的制法已不能满足世界干酪需求量不断增长的需要。利用微生物生物工程技术生产凝乳酶可以获得高纯度的凝乳酶,生产成本低,来源稳定。目前美国有70%、英国有90%的干酪是用生物工程凝乳酶生产的。Beppu等[2]在1983年首次报道利用Escherichiacoli生产凝乳酶,凝乳酶原cDNA在E.coli中表达,导致无活性的酶以包涵体的形式在细胞内积累。通常,在E.colilac启动子[3-4]、trp启动子[2,5]、tac启动子[4]、PR启动子、phoA启动子和T7启动子的控制下,凝乳酶以Met-凝乳酶原或N-末端融合蛋白的形式合成[6]。一些真核生物,包括酵母、真菌已经用于凝乳酶原和凝乳酶的生产。在Saccharomycescerevisiae中,编码凝乳酶原前体、凝乳酶原和凝乳酶的基因在磷酸甘油酸激酶(pgk)、半乳糖苷酶(gal1和gal10)和磷酸丙糖异构酶(tpi)的控制下表达。这些蛋白质主要以不溶形式合成,积累在细胞中难以激活。应用酵母分泌信号,将转录单位整合到酵母基因组和宿主基因组的突变体中,凝乳酶原的分泌至少增加80倍,可被激活的凝乳酶原产量可达20mg/L[7-9]。在Aspergillusnidulans中,凝乳酶在使用源自A.niger的葡糖淀粉酶(glaA)启动子作用下以活性细胞外酶形式合成,但凝乳酶产量较低[10-11]国内对凝乳酶研究也较早,1988年,谭思元等。[12]研究了凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA的克隆,成功分离了凝乳酶原mRNA,并通过拼接pCT5及pCT15获得完整的凝乳酶原基因。唐兵等[13-16]研究了凝乳酶原分子折叠和酶复性,并通过进一步对大肠杆菌中表达调控的研究,有效地在大肠杆菌中表达了牛凝乳酶。最近冯镇等[17]1材料与方法克隆了小牛凝乳酶,并在乳酸克鲁维酵母中进行了分泌表达。毕赤酵母表达系统具有表达量高、能进行蛋白质翻译后修饰、容易大规模生产、生产成本低、外源蛋白基因遗传稳定性较好等特点,目前国内外已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性,获得包括美国FDA在内的广泛认可。它能够对外源蛋白进行翻译后加工,使之更接近于天然蛋白的构象和活性,是一种广泛应用的真核表达系统。目前,在我国尚未见到利用毕赤氏酵母表达牛凝乳酶的报道。本研究通过基因工程的方法构建牛凝乳酶毕赤酵母表达系统,即从小牛皱胃中克隆得到牛凝乳酶基因,将牛凝乳酶基因与酵母表达载体连接,并将连接的载体转入毕赤酵母细胞中,从而表达重组牛凝乳酶。1.1菌株与质粒EasySelectPichiaExpressionKit,吉林省农业科学院李启云博士提供;大肠杆菌JM109、质粒pMD18T-Prochy,本实验室保存。1.2试剂与工程酶ExTaq聚合酶,pMD18T试剂盒,DNAMarkerDL2000、DL15000,购自大连宝生物工程公司;限制性内切酶XhoI、XbaI、SacI,DNA回收试剂盒,T4DNA连接酶,购自MBI公司;SDS、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TEMED等,购自BBI公司;其他试剂均为分析纯。1.3仪器与设备PCR扩增仪,EppendorfMastercyclergradient;全自动凝胶成像系统,AlphaImagerHP;蛋白电泳系统,Bio-radMini-Protean;电转仪,Bio-rad1162ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2009Vol.25No.8Journals.im.ac.cnMicroPulser;台式高速离心机,Eppendorf5415D;紫外可见分光光度计,VarianCary300;高速冷冻离心机,ThermoSorvallEvolutionRC。1.4培养基LLB、YPD、MDH、MMH、BMGY、BMMY培养基的组成和配制参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。1.5PCR扩增目的基因根据对酵母表达载体pPICZaA的限制性酶切位点分析,并参考本实验室已克隆的凝乳酶基因序列(GenBankAccessionNo.FJ768675.1),在基因上下游设计特异引物ZaAProS和ZaAProAS,序列见表1,由上海生工生物工程有限公司合成。下划线部分分别是XhoI和XbaI酶切位点,上游引物中AAAAGA为pPICZα系列载体α分泌因子的KEX2切割位点。表1本实验中使用的引物Table1PrimersusedinthisstudyPrimernamePrimersequence(53)ZaAProSTGCTCGAGAAAAGAGCTGAGATCACCAGGZaAProASTGCTCTAGA5′AOX1ATGATGGCTTTGGCCAGCCGACTGGTTCCAATTGACAAGC3′AOX1GCAAATGGCATTCTGACATCC以质粒pMD18T-Prochy为模板,通过PCR扩增得到牛凝乳酶原基因片段。PCR反应条件:94oC预变性5min;94oC变性30s,52oC退火30s,72oC延伸90s,32次循环;72o1.6酵母表达载体的构建C延伸10min。产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。回收PCR产物,用XhoI和XbaI对回收的PCR产物和质粒pPICZaA分别进行双酶切。将分别回收载体和目的基因的双酶切产物用T4DNA连接酶在16o1.7电转化毕赤酵母GS115C下连接,构建表达载体pPICZaA-Prochy,将连接产物转化大肠杆菌JM109,用LLB琼脂平板(含Zeocin25g/mL)筛选。选择阳性克隆,提取质粒DNA,用XhoI和XbaI双酶切验证后送上海生工生物工程有限公司测序。使用SacI酶切重组质粒pPICZαA-Prochy使其线性化。65oC加热20min使酶失活。制备毕赤酵母GS115感受态细胞。通过电脉冲法将线性化的质粒转化到毕赤酵母GS115中。酵母转化株经YPD液体培养后提取染色体DNA,用PCR方法验证目的基因与染色体整合的情况。在MDH和MMH平板筛选出Mut+1.8重组酵母的诱导表达表型重组菌株。将筛选得到的重组酵母GS115/pPICZaA-ProchyMut+接种于含25mLBMGY培养基的三角瓶中,30oC、300r/min培养16~18h,至OD600达到2.0~6.0。室温下3000×g离心5min,收集菌体,用约200mLBMMY重悬菌体,使OD600为1.0左右。将菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于30oC、300r/min的摇床上进行诱导表达。每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5%,每隔24h取样检测菌液OD600