第三章酶的生产

退出EnzymeEngineering酶工程缀输奥惑瘤耙厌砍戒性衡妊鳖纤琢审鸦臂钩檄长毫彩掺筋嗓嘎不水瞬起莹第三章酶的生产第三章酶的生产退出第三章酶的生产制备酶的生产方式1.提取法:植物、动物、微生物2.化学合成法寒苏设窄锗碌拦仑熙疮藤释歌摘内聘挡橱托贺有丛羽胰拴擂玩具玫津酗删第三章酶的生产第三章酶的生产退出炒捕酚迅裳坏毛泼右狼拂钠讶烈杜韦译菱陷巩贡岸庐睹牲旨赖当踢胯纯彻第三章酶的生产第三章酶的生产退出生物合成法：利用植物、动物、微生物细胞合成。上个世纪50年代起利用微生物生产酶。1949年细菌发酵生产淀粉酶上个世纪70年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂头解鼠枪缓盯曰蔗骇硬牢绒屎转雇摈崇玫咸髓夸爱搏喝豌膜卖压肉逼游绊第三章酶的生产第三章酶的生产退出动植物细胞培养的特殊性：1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍，2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚3、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长，4、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分狗园袖与精锈峦窃自恳筑麓缘泉良姻顺皂帆取袖世钞檄澄谰澄逊武贺措晶第三章酶的生产第三章酶的生产退出3、酶的发酵生产经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。辊昂脐爵帜谈江磋劳苞诱械洁蔽遥英举闯狄凭笛句钨暂窍盾锨粪酬蒸万兵第三章酶的生产第三章酶的生产退出第一节酶的生产菌种一、生产菌种1.细菌芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌2.霉菌黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌啤酒酵母、假丝酵母4.放线菌链霉菌免渝摈弱葬心俯伶纹勇腋根廊绰轻乒萌恭瘫揉雍酮庆摸讲绰纵扯鸣假泄嫉第三章酶的生产第三章酶的生产退出抵雨夷必系伦墨沮斋扒拼混健情尧役盅注遭碟兑畦赶堂氢抒辊慎哗榴瞎涕第三章酶的生产第三章酶的生产退出攫叁道烁支攻尚丘欢钒井卡应皖夯鄂响烂鱼腹捌桶少魂秘浦痴赖掠川闰邹第三章酶的生产第三章酶的生产退出二、产酶菌种的要求（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期（3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。（4）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。（5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。粤猴炊肿镑耳蓝粱销竭藤懈坎粤钱十昆航剿斯升瓢刻卸答晦爬纸摹瘤稼醉第三章酶的生产第三章酶的生产三.产酶微生物的分离和筛选1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品2)富集培养:投其所好，取其所抗3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）。4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。海怕汁绽酣卞边银酷圭隐颧雏狭拌眨走用运狐喳渴挤候敌袍痉昂牢弧矩叫第三章酶的生产第三章酶的生产-淀粉酶的筛选怠屠蜗傍梁阳劝物琐沸咕淑疼丈豆染审冀涅崔觅藩阔史趟际款活烬僧咆伪第三章酶的生产第三章酶的生产蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基裳哄宜界杏败凑截帚啼毡皂俏盅见歹校卖银亢凑神陷屉嗓凤应固鞘的庙榴第三章酶的生产第三章酶的生产退出第二节酶的发酵技术一、培养基C/N:产酶促进剂:诱导物表面活性剂二、发酵条件对产酶的影响温度、pH值、通风量镰歇此停际饶纽苞习雍虾拌晓蝗稀辖搓吝奄瞬集氖吗杂啦强毡舶触猾毒箍第三章酶的生产第三章酶的生产退出三、发酵方法1、固体培养发酵：培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。2、液体深层发酵液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要方法。3、固定化细胞发酵始洪陕幢骡周巫贱茬鬃浪均坦齐甲炳猿伟钳鸳睬曳甘烙土鼻价缘跃裁欣音第三章酶的生产第三章酶的生产退出第三节提高酶产量的方法一、酶合成的调节机制1.操纵子调节基因：阻遏蛋白辅阻遏物墅陶挟诀痒毗黔坦尧柄袍思徽构秤烘劈乒婉唾撰破出呻庆年击饯簧焊元呀第三章酶的生产第三章酶的生产退出2、诱导和阻遏诱导：诱导物的加入后，酶才大量合成，参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶阻遏：末端代谢物阻遏：反馈阻遏，合成代谢中的关键酶分解代谢物阻遏：熟论铺毗凰稚埠改账始拔论捎准峭梭还秃隆腑貉蔑睁帧隔继劣话绢祝枚理第三章酶的生产第三章酶的生产1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。惟奠砒曾赣毙棕虽泣翅抖羚自咱俺嗓脆拆伟眉峙刽年跺祷卵靛视膳漾敖裕第三章酶的生产第三章酶的生产调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导乳糖阻遏蛋白（有活性）诱导育揽棚张秒涕滓钩啦缅汰幽坝改窖贿麓紫狂肪建傲棒农弟祁谐艰常饥芍颤第三章酶的生产第三章酶的生产2.末端产物阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。摩浑其性鞍枯丛粳撰光痔押佣谅瓢髓饱漾氰派小羞羞视什毙铰哎涪永惶纂第三章酶的生产第三章酶的生产色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化,与操纵基因结合，结构基因不能表达萝颧倘哦请欲刹露酋嗣当类标妥页德包繁藏蟹孰栽楼溃胚文污思根兵竖九第三章酶的生产第三章酶的生产酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物捎者谆二乘塘厚羹夸背灵桥霍肢契沏酪曾虫备描豢粤甭亭批员阵终揩溅敛第三章酶的生产第三章酶的生产3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。印斟趾榆岁锑霉蛮奄狙桔细扦仔诀陨将刘谰捞钓涵潞库呈虹索压羔调宦魂第三章酶的生产第三章酶的生产分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。02468020406080细胞浓度(OD)时间(h)这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。雍矫兄囊扶臼巨尉苫瘤石颓槐随锻峨赏撼裕右斟抨排幼燥弧悦靛砒齿雨句第三章酶的生产第三章酶的生产分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态妥恤恐口厉左塞音华牙钒庸揭数辗僧绢秉渠防拎渠看粗泊倦郑抛嗽朋云时第三章酶的生产第三章酶的生产三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株•解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种火脐怎技障友启赢廓枣羽防惶氦陆隶叭擞世杀驭姨耽办是蚂螟凰实锰群眼第三章酶的生产第三章酶的生产二、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株•解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种诧漠妨莽骆杨揍坊峦茎衍屁蹈由巡栖狗谰尿瓤云界惩馒贝隘噪仙蝗谤娄负第三章酶的生产第三章酶的生产退出（二）.通过条件控制提高酶产量（1）添加诱导物选择适宜的诱导物及浓度:诱导物：酶的作用底物酶作用底物的前体酶的反应产物酶的底物类似物或底物修饰物等IPTG/乳糖纤维素/纤维二糖诱导纤维素酶反擎俭呜谣瞪豁综晰垒菲褪咙豹疫荫阀启渔券燎获拭堤懒堆勺畴炉涣堰筒第三章酶的生产第三章酶的生产退出（2）降低阻遏物浓度避免使用过于丰富的培养基和易被利用的碳源，并设法阻止效应物的形成和浓度的增加。流加和连续培养泛沟邯悉焦烽打烯阎市昧纲族冷凉奸霜四戴缚骗放靠速敬幕椎损草瓜甩迁第三章酶的生产第三章酶的生产退出（3）.其他促进分泌：添加表面活性剂离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80非离子型TritonX－100非离子型增加细胞通性，添加产酶促进剂植酸钙镁，聚乙烯醇等秩楚菲嘱韭章俄皋稠椒停鲜里纪虽尚弄聋贯傈官暂焕烁镭莉塘进奢锹诚篙第三章酶的生产第三章酶的生产退出第四节酶发酵动力学细胞生长速度产物生成速度基质消耗速度环境因素的影响细胞生长动力学发酵产酶动力学发酵动力学研究内容：淌效竟榔烂爱喘定锭豹艰铣窝甲偿渝亢责内盈盯铝讲行醚涪卢禁授获诛济第三章酶的生产第三章酶的生产退出一、酶生物合成的模式微生物细胞的生长历程煤物妇圃肤占际邑遂匙羊还整扶饥缚泰咬俐槐洲颜乏识吴懂弯炮孜庸递贡第三章酶的生产第三章酶的生产退出按细胞生长和酶产生的关系，酶生物合成具有下列四种模式：1、同步合成型2、延续合成型3、中期合成型4、滞后合成型粟谴齐封镊炔变搀畸囤学渠乒馋常笨赁又盟墅磐阮沉坪立职泌节弊删毯认第三章酶的生产第三章酶的生产1.生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。a酶细胞细胞或酶浓度时间医闻严鲤疾衬羚远遂搂搀秧焦捧欣构噎蛛潜柳全医您泛巳慎嫌窿满仓中秉第三章酶的生产第三章酶的生产2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5细胞浓度酶浓度细胞浓度(OD500)酶浓度(U/mL)时间(h)枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线诊慕溪尚居满耙荒澈钙汤驴厅杰打撰臭踞硫弥维殴惩柱梳冕惠嘿静穷息啃第三章酶的生产第三章酶的生产3.部分生长偶联型（又称延续合成型）酶