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第十四章基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering主讲许春鹃生化与分子生物学教研室Tel:18970786460QQ:15863025二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。第一节自然界DNA重组和基因转移并非任何质粒DNA都有这种转移能力，只有某些较大的质粒，如F因子方可通过接合作用从一个细胞转移到另一个细胞。（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。细菌溶解新细菌摄取DNA重组图14-3转化作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或类似性。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式交换后的DNA分子同源重组交换点两条同源DNA双螺旋内切酶(RecBCD)DNA侵扰(RecA)分支迁移(RecA)内切酶(RecBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´图14-1同源重组机制Holliday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(RuvC)内切酶(RuvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体图14-1同源重组机制由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合,称位点特异重组(site-specificrecombination)。（一）λ噬菌体DNA的整合一个由病毒编码的特殊重组蛋白质，称为λ整合酶，能识别细菌染色体的一个特定的DNA序列和病毒基因组的另一个序列，它把这两个序列拉到一起并催化两个DNA的断裂和重接，从而把病毒基因组整合进细菌基因组。三、特异位点重组（二）细菌的特异位点重组H2鞭毛蛋白阻遏蛋白Hin重组酶（倒位酶）H1鞭毛蛋白hinH2rH1H1鼠伤寒沙门杆菌H片段倒位决定鞭毛相转变H片段hixhixPPPH片段hixhixhinH2rH1PPH1PH1基因被阻遏三、特异位点重组（三）免疫球蛋白基因的重排V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开、转移核苷酸修复、连接三、特异位点重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。四、转座重组（一）插入序列转座插入序列发生的转座有两种形式：(1)保守性转座：插入序列从原位迁到新位。(2)复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁移到新位，另一个仍保留在原位。（二）转座子转座转座子：可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列。piggyBac转座子的老鼠，表达红色荧光蛋白玉米“花斑”由一种转座因子的存在所导致第二节重组DNA技术重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉克隆羊技术一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆克隆(clone)：指来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning)：指获取同一拷贝的过程，实际上是无性繁殖。克隆可以是不同层次的，分子水平上的克隆称为分子克隆；细胞水平上的克隆称为细胞克隆；整体水平的克隆称为动物克隆或植物克隆。DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）工具酶表14-1限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸内切酶的概念GAATTCCTTAAG+EcoRⅠGCTTAA5′3′3′5′AATTCG3′5′5′3′指可识别双链DNA中特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶(核酸水解酶)。限制性核酸内切酶天然存在于细菌体内，与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。限制性核酸内切酶的分类根据酶的组成、所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。基因工程技术中常用的为Ⅱ类酶。限制性核酸内切酶的命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性核酸内切酶一般以提取这类酶的生物的属名和种名的第1、2个字母及菌株（型）的代号来命名。限制性核酸内切酶的作用机制限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3′-OH基团和5′-磷酸基团的末端。Ⅱ类限制性核酸内切酶的识别序列GGATCCCCTAGG5′3′3′5′限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，其序列从5′端到3′端回折后能互补，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。BamHⅠGGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTG平头末端或钝性末端黏性末端GCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+5′3′5′3′3′5′3′5′3′5′5′3′5′3′3′5′配伍末端有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端，这两个相同的黏性末端称为配伍未端。BamHⅠGGATCCCCTAGG5′3′3′5′+GCCTAGGATCCG5′3′3′5′+ATCTAGGATCTA5′3′3′5′BglⅡAGATCTTCTAGA5′3′3′5′（三）目的基因用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(targetDNA)。目的基因的类型cDNA(complementaryDNA)指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。基因组DNA(geneticDNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。（四）基因载体基因载体的定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用的基因载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA从构建克隆载体的DNA来源不同分类克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。从应用范围来分类，基因载体可分为：理想的基因载体应具备下列条件：①具有合适的克隆位点（酶切位点），便于外源DNA的插入;②能携带目的基因进入宿主细胞，具有自主复制能力;③具有可检测的选择标记，便于重组体的筛选和鉴定;④载体分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量，同时载体DNA与宿主DNA便于分离;⑤安全，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除宿主细胞以外的其它生物的细胞。1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒常用的基因载体pBR322质粒载体图谱常用的基因载体pUC19质粒载体图谱常用的基因载体2.噬菌体载体噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类，前者为λ噬菌体类，后者主要有M13噬菌体和f1噬菌体。头部尾部DNA尾部纤维衣壳常用的基因载体λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体载体M13噬菌体DNA改造系统:M13mp系列和pUC系列（适用于外源单链DNA的克隆）3.动物病毒载体4.酵母人工染色体载体(克隆外源DNA大片段)基因工程中要根据具体的实验需要，选择合适的克隆载体或表达载体，同时对每一种载体必须选用合适的宿主细胞，方能达到最佳的克隆和表达效率。常用的基因载体二、重组DNA技术基本原理及操作步骤目的基因的获取重组DNA分子导入宿主细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达分切接转筛图14-10以质粒为载体的DNA克隆过程重组DNA增殖载体外源DNA重组DNA分子细菌转化或转染筛选含重组质粒的细菌细菌在培养液中繁殖后,在固体培养基上生长（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)二、重组DNA技术基本原理及操作步骤（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建利用DNA连接酶和双链粘末端单链序列互补结合的配合使用将外源DNA与载体共价连接。根据实验目的、操作基因的性质不同，选择合适的载体并构建克隆载体。二、重组DNA技术基本原理及操作步骤(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接1.黏性末端连接BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAGDNA连接酶+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连1.黏性末端连接3′5′5′3′5′3′3′5′2.平端连接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶载体自连目的基因自连重组体选择宿主细胞条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)根据采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同方式。（四）重组DNA导入宿主细胞二、重组DNA技术基本原理及操作步骤基因工程中使用的宿主细胞主要有大肠杆菌、酵母细胞、各种来源的哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等。1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Sout