酶的作用机理

15.4酶的作用机理（一）基本概念：酶的活性中心是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位和催化部位。1．结合部位（Bindingsite）酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。2．催化部位（Catalyticsite）酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。5.4.1酶的活性中心(Activecenter)2必需残基:酶分子中有些基团若经化学修饰（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，则酶的活性丧失，这些基团称为必需残基。非必需残基：有的酶温和水解掉几个AA残基，仍能表现活性，这些基团即非必需残基。结合基团—与S结合的部位（结合中心）接触残基Activecenter催化基团—催化S发生反应的部位（催化中心）辅助残基－促进结合基团与底物结合，促进催化基团对底物的催化作用结构残基－稳定酶的构象和对酶的活性间接起作用活性中心外的残基非贡献残基－对酶的稳定和其它方面起作用，由非必需残基组成（由必需残基组成）3底物产物Cleft，creviceorcavities(裂缝、凹穴、裂沟)为疏水的微环境45（二）酶活性中心的结构特点1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。某些酶活性部位的AA残基酶AA残基数活性部位的AA残基RNase124His12,His119,Lys41Lysozyme（溶菌酶）129Asp52,Glu35Chymotrypsin（胰凝乳蛋白酶）241His57,Asp102,Ser195Pepsin（人胃蛋白酶）348Asp32,Asp215Papain（木瓜蛋白酶）212Cys25,His159CarboxypeptidaseA（羧肽酶A）307Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+6亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNH常见酶活性中心的基团7酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。H2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH常见酶活性中心的基团82.酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作）3.酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（induced-fit）.4.酶活性部位位于酶分子表面的一个裂隙(crevice）内.裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。5.底物靠许多弱的键力与酶结合。9（三）判断和确定酶活性中心的主要方法酶的专一性研究：研究酶的专一性底物的结构特点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。酶分子侧链基团的化学修饰法：例如1.用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团；2.亲和标记（合成底物类似物）X-射线晶体衍射法：定点诱变法10用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团DFP的作用二异丙基氟磷酸Inactiveenzyme1112专一性抑制剂：N-对甲苯磺酰－L－赖氨酰氯甲基酮(TPCK)底物：N-对甲苯磺酰－L－赖氨酰甲基酯(TPE)Trypsin(胰蛋白酶)的底物和专一性抑制剂13牛胰蛋白酶用DFP修饰得知Ser195,用TPCK得知His189,用X-光衍射等方法得知Asp102这些必需基团。14Chymotrypsin(胰凝乳蛋白酶)的底物和专一性抑制剂底物：N-对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰乙基酯专一性抑制剂：N-对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK）与必需基团His57结合15判断抑制剂是否与酶的活性中心必需基团结合的标准：1.反应速度的降低与[I]正比关系，即失活程度与修饰程度之间成化学计量学关系（Stoichiometricrelationship）。100%V50%00.51.0Degreeofmodification(Sidechainsperactivecenter)162.底物、竞争性抑制剂具有保护作用(Protectioneffect)，即在修饰过程中，加入竞争性I或S,则E的失活减慢。100%50%00.51.0VWithsubstrateorcompetitiveinhibitoerNosubstrateorcompetitiveinhibitoerTime175.4.2酶作用专一性的机制1.锁钥学说（1894年EmilFischer）—lockandkey或模板学说（template）：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。182.诱导契合学说（1958年D.Koshland)_inducedfit：该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状,从而有利于底物的结合。概括其要点：四个方面A.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板B.底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）C.当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。D.在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。19203.三点附着学说（Three-pointattachmenthypothesis）认为立体异构的一对S，虽然基团相同，但空间排列不同。因而与酶活性中心基团不能同时互补，只有三点都配匹互补，才能结合而发生作用。用它来解释甘油激酶的作用正适合。甘油1-磷酸甘油酸L-(+)-Lacticacid1231甘油激酶214.结构性质互补假说（Structure-propertiescomplementationtheory）S的结构和E活性中心三维空间结构互补外，在E和S的性质方面也有要求。如果底物带电荷，酶的活性中心必带相反电荷，同时底物和活性中心的极性也必然相同。22COO-CAspActiveSiteTrypsinChymotrypsinElastasecutatLys,ArgcutatTrp,Phe,TyrcutatAla,GlyNon-polarpocketDeepandnegativelychargedpocketShallowandnon-polarpocketOO–C–N–C–C–N–CCCCNH3+OO–C–N–C–C–N–COO–C–N–C–C–N–CH3JuangRH(2004)BCbasics23（一）降低反应的活化能（activationenergy,Ea）活化能:在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是KJ/mol.（增加温度、加入催化剂降低反应活化能）酶促反应：E+S===ES===ES*EPE+P非酶促反应：5.4.3酶作用高效率的机制催化剂的作用是降低反应活化能,从而起到提高反应速度的作用24酶促反应实例：H2O2的分解无催化剂时活化能为75.24KJ/mol;铂为催化剂时48.9KJ/mol;Catalase为催化剂8.36KJ/mol25中间产物学说在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+SE－SP+E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。（电子显微镜的观察结果、X-射线晶体结构分析、酶与底物反应前后光谱特性分析、酶的溶解度变化、酶与底物的共沉降，获得ES复合物结晶）2627282930邻近效应:在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应。曾测得一酶促反应，[S]=0.001mol，活性中心[S]=100mol，达十万倍。定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。靠近和定向可能使反应速度提高108倍。（二）邻近效应（Proximityeffect）和定向效应（Orientationeffect）31（三）酶使底物分子中的敏感键发生变形（Distortion）酶-底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。32酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。（四）多功能催化作用331.Acidbasecatalysis酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。按酶催化反应的机制分类34广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）-COOH,-NH3,-SH,+OHNHNH+-COO,-NH2,-S,-..-O-NHN:酶分子中可以作为广义酸、碱的基团His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。(pK=6)半寿期小于1010秒352.Covalentcatalysis催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：His的咪唑基，Cys的巯基，Asp的羧基，Ser的羟基等；亲电子基团：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。36１.需要金属的酶分类：（1）金属酶－Metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+（2）金属-激活酶（metal-activatedenzyme）:含松散结合的金属离子，如Na+K+Mg2+Ca2+2.金属离子的催化作用：许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。许多激酶的底物为ATP-Mg2+复合物。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。(五)金属离子的催化作用37酶活性中心处于一个非极性环境中，从而有利于同底物的结合。（水的极性和形成氢键的能力都较强，能够减弱极性基团间的相互作用）（六）微环境的影响（酶活性中心是低介电区域）385.4.4酶促反应机理的举例1.溶菌酶（Lysozyme）EC3.2.1.17,催化细菌胞壁多糖水解。①溶菌酶作用的最适底物(Bestsubstrate)R：CH3－CH2－COO－39②溶菌酶的结构129Aa，4对=S，MW13900，Glu35、ASP52为催化基团。35、52间有一狭长凹穴，S正好嵌合其穴中。40溶菌酶的活性中心bindinggroupsAsp101Trp62Trp63Trp108catalyticgroupsAsp52Glu3541a.E,S接触后，E变构，使Glu35-CO－O与D环糖苷键－O仅3Å，Asp52-CO—O与D环C1仅3Å（靠近，定向作用）b.糖链D环变形，从椅式→船式（敏感键变形）