血培养

1临床微生物实验室血培养操作标准1范围本标准规定了血培养标本临床微生物检验的技术要求。本标准适用于开展血培养的临床微生物实验室。2术语一套血培养：从同一穿刺点同时采集的血液标本，分别注入需氧和厌氧培养瓶；静脉输液缸：一种植入皮下，可长期留置在体内的静脉输液装置；HACEK菌群：嗜沫嗜血杆菌、人心杆菌、啮蚀艾肯菌和金氏金菌；血培养污染率：一般由凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌、座疮丙酸杆菌和微球菌等污染引起的阳性瓶占总送检瓶数的比例。3导言人体血液中有很多物质，包括溶菌酶、白细胞、免疫球蛋白、补体等，可在几分钟内将入侵血流的微生物清除。当微生物感染超出人体免疫系统的防御能力时，人体将不能将微生物局限于原始感染的部位，或在治疗中不能通过切除、引流等措施清除感染源，那这些微生物将侵入血液迅速繁殖形成菌血症或真菌血症。一过性菌血症常发生于对感染病灶的外科处理、黏膜的创伤操作和易污染的外科手术，亦可发生于感染性心内膜炎等血管内膜感染以及伤寒和波浪热的最初几周。菌血症是临床急症，应尽快采集血液进行培养。血培养是对入住急诊科、ICU患者、移植患者以及静脉插管患者的败血症进行早期诊断的一种方法，并根据阳性血培养病原菌的药物敏感性试验，可为临床医生提供最佳的抗菌药物治疗方案，对降低病死率有很大的帮助，血培养对于临床诊断和预后评估也有重要的意义。4血样采集和培养瓶接种4.1采血指征可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可考虑采集血培养：发热（≥38℃）或低温（≤36℃）寒战，白细胞计数增多（计数10.0×109/L，特别有“核左移”时）或减少（计数3.0×109/L）,皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素原（PCT）、1，3－β－D－葡萄糖（G试验）升高及突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变。24.2采血时间及套数4.2.1采血时间推荐在寒战或高热高峰前后采集，用抗菌药物之前采集。4.2.2血培养套数应同时采集2~3套培养瓶，2~5天内无需重复采集血培养。只有在怀疑感染性心内膜炎或其它血管内感染（如导管相关性感染）时，才能必要间隔多次采集血培养。对于新生儿，采集一瓶儿童需氧瓶，建议同时做尿液和脑脊液培养。4.3采血量成人每瓶采血量8~10ml，儿童1~15ml，但不应超过患儿总血量的1％。血液和肉汤之比为1：5~1：10。新生儿0.5ml。4.4需氧瓶和厌氧瓶间的血液分配4.4.1采血量充足的患者推荐配套采集需氧瓶和厌氧瓶，将血液先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶。4.4.2采血量不足的患者应将足量血标本先注入需氧瓶，再将剩余血液注入厌氧瓶。有利于分离出真菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌。4.5血培养采集程序4.5.1采集血培养标本之前首先做好手卫生。静脉穿刺点选定后，去除血培养的朔料瓶帽，切勿打开金属封口环和胶塞，使用70％异丙醇或75％乙醇消毒，自然干燥60s；4.5.2在穿刺前或穿刺期间，防止静脉滑动，可戴无菌乳胶手套固定静脉；4.5.3穿刺点皮肤消毒；4.5.3.1三步法1）75％酒精擦拭静脉穿刺部位，待干30s以上；2）1％~2％碘酊作用30s或10％碘伏60s，从穿刺点向外画圈消毒至消毒区域直径达3cm以上；3）75％酒精脱碘：对碘过敏的患者，用75％酒精消毒60s,待酒精挥发干燥后3采血。穿刺点消毒后不可再接触。4.5.3.2一步法：0.5％葡萄糖酸洗必泰作用30s（不适用于2个月以内的新生儿），或70％异丙醇消毒后自然干燥。4.5.4用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（如果行第二次穿刺，换针头），直接注入血培养瓶，不可将抗凝血注入商品化培养瓶。4.5.5血液接种到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固。4.5.6完成工作后洗手。5血培养瓶运送血培养瓶应尽快送至实验室孵育或上机，如果运送延迟，应在血液接种后尽快35~37℃孵育，切勿冷藏或冷冻。如果病房没有孵箱，血培养瓶应置于室温，而非冷藏或冷冻。6血培养标本的接受收与拒收标准6.1实验室工作人员在收到标本之后应观察血培养瓶生长指示信号，如果指示有细菌生长，则应进行涂片镜检。6.2血培养瓶一般不予拒收，如发现以下情况：血培养瓶标识错误或没有标识，破碎，损坏，渗漏，凝血等情况，应及时与临床联系。7实验室操作方法及流程7.1影响检出率的关键因素7.1.1培养基胰酶消化的大豆肉汤（TSB）是应用最广泛的基础培养基，脑心浸液、哥伦比亚布鲁氏、硫醇基乙酸盐和添加蛋白胨肉汤也是较常见的用于需氧菌和厌氧菌的培养基。Middlebrook肉汤可增强分枝杆菌的复苏能力。7.1.2添加剂抗凝剂茴香脑磺酸钠（SPS），能中和溶菌酶，抑制吞噬作用，使部分氨基糖苷类失活，抑制部分补体串联。浓度为0.025~0.05％，有些浓度低到0.006％。4SPS会抑制部分细菌生长，包括奈瑟菌属、厌氧消化链球菌、卡他莫拉菌和阴道加德纳菌。除了营养肉汤可稀释血液以及SPS可降低血中抗生素对细菌的抑制作用外，某些血培养瓶中加入了抗生素中和或吸附剂，如树脂。抗凝剂肝素、EDTA和柠檬酸盐对微生物有毒性，不能用于培养瓶中。7.1.3孵育条件7.1.3.1温度：35~37℃孵育。7.1.3.2气体：出厂的血培养瓶中的气压低于大气压以保证能注入足量血液。有些手动系统，培养瓶必须用针制造一个需氧的气体环境。厌氧瓶顶端的气体中含有二氧化碳和氮气。7.1.3.3自动化血培养系统每间隔一定时间检测需氧和厌氧瓶中微生物生长信号。当有阳性信号时进行处理（详见9：血培养阳性结果处理和报告程序）。对于已经培养5d的阴性瓶不需要常规盲传或终点转种。7.2血培养方法7.2.1手工血培养7.2.1.1传统肉汤培养需氧培养基：脑心浸液肉汤、哥伦比亚肉汤或胰酶消化大豆肉汤；微需氧或厌氧培养基：硫醇或硫基乙酸盐。苛氧菌培养需添加溶血素、维生素k1，L型半胱氨酸。抗凝剂采用0.025~0.05％的SPS。推荐添加树脂中和抗菌药物。肉汤的体积为18~100ml。7.2.1.2双相培养基同时含有琼脂和肉汤的血培养瓶，可用于成人或儿童患者的需氧菌、厌氧菌和分枝杆菌培养。培养瓶需要垂直孵育，同时观察肉汤和琼脂表面有无微生物生长。7.2.1.3溶血离心法溶血离心法是将微生物从溶解的血液中释放出来后，通过离心将其与血液成分分离，因浓度不同而聚集在收集管底层的一种血培养方法。从溶血离心管底层沉淀物转移至固体培养基进行孵育。7.2.1.4孵育时间：手工法推荐35～37℃孵育7d，一些缓慢生长的苛氧病原菌（巴尔通体、李斯特菌属、布氏杆菌属和奴卡氏菌属）和双相真菌可能需要更长的孵育时间。手工法需要每天观察培养状态，如无生长迹象后摇动再孵育。57.2.1.5检测的频率和转种：手工法需每天或更频繁的观察微生物肉眼可见的生长，应特别注意孵育48h内的生长迹象。检测培养时需明亮的荧光灯或白炽灯，观察浊度、溶血、产气、表面菌落形成和血液颜色的改变，发现有微生物生长迹象进行涂片革兰染色和转种，根据涂片染色结果选择培养基类型。7.2.2自动化培养原理：通过电子感应器检测微生物生长代谢的CO2浓度、监测其生长。孵育时间：35～37℃孵育5d，包括布鲁菌属、嗜血杆菌属、放线菌属、心杆菌属、埃肯菌属、金氏杆菌属和营养变异性链球菌（乏氧菌属和颗粒链球菌属）也可检测出来。某些缓慢生长的苛氧菌（巴尔通体、李斯特菌属和奴卡菌属）和和双相真菌可能需要更长的孵育时间。血培养仪阳性报警后，立即进行涂片革兰染色和转种，根据镜检结果决定转种的培养基类型。对于已使用抗菌药物治疗的患者，建议采用含树脂等中和物质的培养瓶，可提高细菌的检出率、缩短检出时间。7.2.3真菌血液培养7.2.3.1危险人群真菌血症与创伤性或消化道粘膜溃疡、广谱抗细菌药物的应用、静脉营养、中心静脉插管和免疫抑制剂使用有关。血培养中最常分离的酵母菌，包括白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和新型隐球菌，其它念珠菌（如克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌和季尔蒙念珠菌）、糠秕马拉色菌、红酵母属和毛孢子菌属分离率较低。马内菲青霉素是最常见的双相真菌。荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、镰刀菌、赛多孢菌、外瓶菌、喙枝孢霉菌少见，多在AIDS、血液恶性肿瘤、骨髓及器官移植和其它严重的免疫缺陷疫病的患者中分离出。7.2.3.2培养条件酵母菌在需氧瓶中易生长。摇动肉汤培养可提高酵母菌的检出率，对于全自动商品化血培养系统或手工培养系统孵育最初24h的机械摇动都可实现。多数酵母菌孵育2～5d可检测出，某些酵母菌（如光滑念珠菌和新型隐球菌）可能需要延长孵育时间。糠秕马拉色菌需要在培养基中添加树脂（如橄榄油）。如果怀疑双相真菌或丝状真菌感染，孵育时间可能需要延长至2～4周。7.2.3.3方法—手工检测法真菌血症检测的手工培养瓶包括：1）营养肉汤培养瓶，2）双相培养瓶，3）溶血离心培养瓶。酵母菌应用这三种培养瓶都可检测出，但是双相真菌和丝状真菌只能用双相培养瓶和溶血离心培养瓶可靠检测。双相培养瓶在酵母菌、双相真菌和丝状真菌的培养中可以应用，其中双相真菌需孵育4周时间。双相培养瓶在孵育的最初24h内，应轻轻摇动。双相真菌和丝状真菌在溶血离心培养基中的检6测时间要早于其它手工血培养系统，离心浓缩的血液沉淀物应接种到多种琼脂培养基，27～30℃和35～37℃同时孵育。7.2.3.4方法—自动化检测法建议采用专用真菌血培养瓶，可提高酵母菌的检出率、缩短检出时间。7.2.4分枝杆菌血培养7.2.4.1危险人群分枝杆菌血症易发生在免疫抑制患者中，如AIDS、白血病、多发性骨髓瘤和其它恶性肿瘤、接受高剂量类固醇激素或细胞毒性化疗和长期的血管置管的患者。最常分离的是结核分枝杆菌和鸟分支杆菌复合体。其他缓慢生长分枝杆菌，包括堪萨斯分支杆菌、猿分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和日内瓦分枝杆菌也已分离到。快生长分枝杆菌引起的菌血症（如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌）与长时间的置留中心静脉导管和人工植入物感染相关。7.2.4.2培养条件分枝杆菌不是专性苛氧菌，如果孵育时间延长，也能够在普通血培养肉汤中生长。血培养中分枝杆菌的最佳培养方式是在肉汤中添加脂肪酸（如不饱和脂肪酸）、白蛋白和CO2。分枝杆菌有些种（日内瓦分枝杆菌和嗜血分枝杆菌）生长时需要添加剂（分枝杆菌生长素、溶血素、血红蛋白或柠檬酸铁胺）。由于分枝杆菌繁殖缓慢，所有培养应至少孵育4～6周。7.2.4.3方法—手工检测法血标本在接种前，必须通过溶血素释放细胞内的菌体。应使用含有抗凝剂的无菌管(如SPS、肝素和柠檬酸盐，但不能使用EDTA)或者溶血离心管收集。全血不能直接接种于不含溶血素的固体培养基或肉汤。用溶血离心管收集的血标本可接种在各种固体、肉汤或双相培养基上；但固体培养基上培养效果不如肉汤和双相系统。阳性标本在双相培养系统中生长速度慢于自动化培养系统。7.2.4.4方法—自动化检测法自动化系统的培养基中添加了各种生长因子和抑制杂菌生长的抗菌药物。不同系统在检测时间上有差别。建议采用分枝杆菌专用血培养瓶，以提高阳性率。8血培养安全防护对所有标本操作都应采取生物安全防护措施，血培养中的病原菌可能通过呼7吸道或直接接触污染实验室工作人员的皮肤、眼或者粘膜引起感染。另外，工作人员间接暴露于污染的物体表面或分离到的病原菌，有实验室获得感染风险，需要个人防护用品及微生物安全柜等设备。8.1实验室获得感染途径针刺伤病毒感染、包括乙肝病毒、丙肝病毒和HIV；皮肤粘膜暴露是肝炎病毒和逆转录病毒感染的主要途径，而其它的主要途径是气溶胶或微滴。8.2防护措施8.2.1洗手洗手是预防实验室获得感染的关键要素。在戴手套前、摘手套后、工作结束后、离开实验室和进入清洁区时，都必须洗手。如直接接触血液或任何潜在的感染性物质后必须立即清洗暴露部位。8.2.2防护屏障采集血培养时应戴手套，采集下一患者时必须换手套。血液污染手套、有破损迹象或失去防护作用时，必须及时更换。在接收和处理标本时，需要戴手套。可能发生血液或其它感染性物质喷溅的情况下，需要面部防护。在没有安全柜的情况下，血培养操作和检验时需要穿防水、长袖、前面封闭的隔离服