功能基因组学

第二讲基因组序列诠释问题基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？1.寻找基因1.1根据开放读码框预测基因A起始密码子ATG第一个ATG的确定(依据Kozak规则);Kozak规则是基于已知数据的统计结果.所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律.Kozak规则:若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1,2，3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。B信号肽分析信号肽分析软件(SignalP)把预测过程中证实含完整mRNA5’端的序列翻译为蛋白序列;然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽;C终止密码子终止密码子:TAA,TAG,TGAGC%=50%终止密码子每64bp出现一次；GC%50%终止密码子每100－200bp出现一次；由于多数基因ORF均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是ORF不少于100个密码子。D3’端的确认3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。E非编码序列、内含子高等真核生物多数外显子长度少于100个密码子，有的不到50个密码子甚至更少；F密码子偏爱性编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。G外显子－内含子边界外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如:内含子的5‘端或称供体位（donorsite）常见的顺序为5’－AG↓GTTAAGT-3’；3’端又称受体位（acceptorsite),多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；H上游控制顺序几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。通过同源性比较来预测mRNA的5’端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(TheTRADATProject,EukaryoticPromoterDatabase,EPD.)。另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。I软件预测采用NCBI的ORF预测软件(ORFfinder:)判断ORF的可能范围。1.2同源查询途径通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。同源有如下几种情况：ADNA序列某些片段完全相同；B开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；C开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；D模拟多肽高级结构相似1.3试验分析Northern杂交确定DNA片段是表达序列.注意事项：a当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带;如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；b考虑组织专一性和发育阶段的问题；C基因表达产物丰度的问题如果风度较低，用拟Northern杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。拟Northern杂交——根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。动物园杂交——根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的DNA顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交。2获取基因全长cDNA序列A构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。cDNA文库构建(CLONTECH)cDNA文库构建B根据已知片段设计引物，RACE技术得到基因的全长cDNA序列。5’RACE(CLONTECH)3’RACE(CLONTECH)3.确定DNA顺序中基因的位置A通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；B通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；4.实验确认基因功能4.1基因剔除(knock-out)最简便的基因失活的方法.主要原理:在一段无关DNA片段的两测连接与代换基因两测相同的顺序,将这一构建导入目的细胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因.tk胸苷激酶标记基因←gangcyclovirneor新霉素抗性基因→G4184.2基因超时表达通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达,致使受体表现出生长与发育的异常,来研究基因的功能.4.3反义RNA反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA(senseRNA)或DNA编码顺序结合,干扰mRNA的转录,加工和转运,调控基因的表达.构建反义RNA表达载体:将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体→转化目标生物→获得转基因个体或品系→分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异→判别目的基因的功能p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35SproNcoISpeIBstEIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35SproNcoIBstEII正义表达载体反义表达载体反义RNA作用机理：A干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。B与mRNA的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。C反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。4.4RNAi干涉RNAi干涉是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制.RNAi作用机理AdsRNA核酸内切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成21~25个核苷酸长的RNA链;B这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RISC(RNA-inducesilencingcomplex,RNA诱导沉默复合体)的指引物,结合到RISC上,使之识别并降解mRNA,从而导致与双链RNA同源的基因沉默;RNAi设计方法及应用AFraser合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA→微量注射和喂食→干扰同源基因的表达BChuang等设计出嵌合体结构→连接强启动子大量表达双链mRNA→干扰同源基因的表达HbF基因的RNAi载体构建RNAi技术的优缺点RNAi最根本的特点是特异性RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代;RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因,RNAi也会同时作用与它们.4.5酵母双杂交（yeasttwo-hybridization）原理：其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。正常条件下：转录因子（包括两个功能区域）→结合功能域同基因上游的区段结合→激活功能域激活RNA多聚酶→将基因转录为mRNA酵母杂交系统中：融合表达载体1融合表达载体2DNA结合功能域+目的片段激活功能域+多种未知cDNA融合表达载体1同一细胞融合表达载体2形成聚合物，启动报告基因的表达表达载体共转化4.6其他方法构建转座子突变库噬菌体外显内含子归槽突变开放读框顺序标签本节课主要内容:如何预测基因RACE技术RNAi技术基因剔除法5.基因表达6.蛋白组学下节课本节内容结束谢谢!