核酸血液筛查(上海浩源)

核酸血液筛查April16,2020P1分子生物学概论一核酸血液筛查相关技术二三目录P2核酸血液筛查系统April16,2020四血站核酸检测样本的采集、运送和保存三PCR实验室的污染防治分子生物学概论P3April16,2020核酸的分子组成-核苷酸分子生物学概论P4April16,2020DNA的一级结构CytosineAdenineThymineGuanineHydrogenBondsDeoxyribose(Sugarmolecule)PhosphoricAcid(Phosphatemolecule)•由A/T/G/C四种单核苷酸组成分子生物学概论DNA的二级结构P5April16,2020DNA分子由相互平行、走向相反、碱基互补的两条脱氧核糖核苷酸链围绕同一中心轴，盘绕成双螺旋结构，螺旋的一侧为大沟，另一侧为小沟。平行链对应碱基总是A==T、G===C配对（basepairing)或互补，形成稳定联系。DNA双螺旋结构P6April16,2020分子生物学概论核酸的理化性质DNA的热变性与复性DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火annealingDNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。慢骤分子生物学概论P7April16,2020核酸分子杂交hybridization当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。分子生物学概论P8April16,2020DNA半保留复制DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每—条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制(replication)。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(semiconservativereplication)。核酸血液筛查相关技术P9April16,2020核酸血液筛查相关技术磁珠法提取核酸荧光PCR技术与TMA技术UNG-dUTP防污染系统内对照分子核酸血液筛查相关技术P10April16,2020磁珠法提取核酸•样品核酸提取•磁珠法核酸血液筛查相关技术P11April16,2020磁珠法提取核酸第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠。第二步：结合核酸：pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合核酸血液筛查相关技术P12April16,2020磁珠法提取核酸第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）。第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来。核酸血液筛查相关技术P13April16,2020PCR技术5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物加入试管中核酸血液筛查相关技术P14April16,2020PCR技术循环循环延伸5’3’5’3’继续延伸5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaq循环核酸血液筛查相关技术P15April16,2020PCR技术5’3’3’3’3’5’3’3’5’3’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’第n个循环2n个拷贝核酸血液筛查相关技术P16April16,2020PCR技术分子生物学概论P17April16,2020TMA技术核酸血液筛查相关技术P18April16,2020TMA与PCR比较TMAPCR扩增原理模拟自然DNA转录成mRNA的过程模拟自然DNA复制的过程靶目标RNADNA酶MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反应体系两种酶，两条引物，dNTP,NTP一种酶，一对引物，dNTP温度条件恒温（41.5℃）循环导热（变性，退火，延伸）扩增仪器水浴箱或者加热块热循环仪扩增产物RNADNA扩增速度每个循环可以生成100-1000个复制物，在15-30分钟内可增加10亿倍复制物以2n扩增，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大10亿倍核酸血液筛查相关技术P19April16,2020荧光PCR技术SYBRGREENMolecularbeacon核酸血液筛查相关技术P20April16,2020TaqMan荧光PCR技术RRQQforwardprimerreverseprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRRRQQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageRRR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQQQRRRR=ReporterQ=Quencher3'核酸血液筛查相关技术P21April16,2020TaqMan荧光PCR技术5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimersAddMasterMixandSampleDenaturationAnnealingReactionTubeTaqlRQProbeRQ核酸血液筛查相关技术P22April16,2020TaqMan荧光PCR技术5’3’ExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaqQR5’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’TaqR5’4.Detection5’3’TaqR5’lRRQ核酸血液筛查相关技术P23April16,2020荧光定量PCR技术•一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。核酸血液筛查相关技术P24April16,2020CT值与阈值CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。核酸血液筛查相关技术P25April16,2020CT值与阈值实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数（图）。“基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是CT值。核酸血液筛查相关技术P26April16,2020荧光定量PCR检测流程图核酸血液筛查相关技术P27April16,2020UNG-dUTP防污染系统UUUU50℃,2minUNGUNG：Uracil-DNAGlycosylase，也称为UDG，尿嘧啶糖基化酶核酸血液筛查相关技术P28April16,2020UNG生化特性1234无作用：游离U、A、T、G、C和RNA不耐热：37-50℃95℃分子量小球蛋白发挥作用不依赖于Mg2+作用范围：单链和双链U碱基糖苷键核酸血液筛查相关技术P29April16,2020dUTP-UNG系统实施的必要性1.产物污染2.交叉污染3.试剂污染4.天然核酸的污染实验室污染1.物理分区2.紫外线照射3.高压消毒4.10%次氯酸钠5.DNaseI消化6.UNG消化核酸血液筛查相关技术P30April16,2020dUTP-UNG作用原理特异地识别DNA分子中尿嘧啶核苷切割下来，形成自由的尿嘧啶和“糖-磷酸”骨架加热或碱性条件下，DNA在“糖-磷酸骨架”处断裂模板无法扩增dUTP代替dTTP扩增，形成UNG有效作用底物U-DNA核酸血液筛查相关技术P31April16,2020dUTP-UNG作用示意图核酸血液筛查相关技术P32April16,2020dUTP-UNG优缺点缺点优点TextText1.防止含dU产物的污染2.不影响目的片段的扩增3.作用条件简单，易实现。1.只防自身产物的污染，不防天然产物的污染。2.若混有核酸酶，会同时分解目的产物。3.UNG致使CT值增加，易导致假阴性。4.dUTP在对GC丰富的模板时作用不大。5.灭活不够完全。6.相对用dTTP，成本高。核酸血液筛查相关技术P33April16,2020内对照分子TextText内参照的概念人工合成的小片段DNA，放在反应液中和待测目的基因一起扩增。内对照是PCR方法检测疾病基因的必需成分，是防止假阴性、提高检测结果可靠性的重要标示。内对照对整个实验流程，包括样品提取、分装、PCR热循环仪孔间差、PCR抑制元素等等可能的影响因素进行监控，防止假阴性，提高安全性核酸血液筛查相关技术P34April16,2020竞争性内对照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)两端为特异性引物目的基因片段内对照顺序竞争性内对照的概念–与目的基因使用相同的引物。–扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。核酸血液筛查相关技术P35April16,2020竞争性内对照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)内对照特异性引物目的基因片段内对照顺序非竞争性内对照的概念–与目的基因使用不同的引物。–扩增产物序列与目的基因不同，可用不同的探针检测。目的基因特异性引物核酸血液筛查相关技术P36April16,2020内对照分子内对照的作用真实反应扩增效率避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最重视的问题之一，内标全程进行质量监控质控血筛核酸检测的内对照设计理念中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取、反转录、及扩增过程的效率。内对照选用：最好能达到上述三个条件，且能顾及仿真病毒的安全性。核酸血液筛查系统P37April16,2020核酸血液筛查系统核酸检测样本汇集设备自动化核酸提取设备PCR扩增和扩增产物的检测设备核酸血液筛查系统P38April16,2020核酸血液筛查系统分析后采集容器采集方式保存运输不合格样本：脂血、溶血、样本量不足样本分析中分析前检测结果纯化试剂准备仪器维护自检准备：质控样本试剂前处理混样信息录入扩增检测核酸纯化检测系统试剂`设备质控品检测试剂的准备核酸血液筛查系统P39April16,2020核酸检测样本汇集设备加样器HAMILTON液体工作站核酸血液筛查系统P40April16,2020自动化核酸提取设备自动化核酸提取(EZbeadsystem-32)核酸血液筛查系统P41April16,2020PCR扩增和扩增产物的检测设备ABI7500实时荧光定量PCR仪血站核酸检测样本的采集、运送和保存P42April16,2020血站核酸检测样本的采集、运送和保存样本的采集样本的运送样本的接收与保存血站核酸检测样本的采集、运送和保存P43April16,2020关注采集、保存、运输的细节运输条件献血员采血管血清管血浆管离心前保存温度保存时间离心后保存温度保存时间实验室接收后至检测前的保存离心采血管P44April16,2020标本的采集-采血管无菌真空采血管一、血清管普通血清管带分离胶的血清管二、抗凝管EDTA2K或3K抗凝管EDTA2K抗凝间分离胶（PPT)枸橼酸钠抗凝管血站核酸检测样本的采集、运送和保存P45April16,2020标本的采集-离心离心条件800-1600g20min离心分离的时间要求—HCVRNA和HIVRNA研究方式不同（样本、检测）结论差异大离心时间完成地点血站核酸检测样本的采集、运送和保存P46April16,2020标本的运送•2-8°C稳定48hr采血车运送实验室血站核酸检测样本的采集、运送和保存P47April16,2020标本的接收、保存•确认标本数量•运输状态•标本状态：溶血、脂血•保存：用于检测的样本管：检测前保存用于留样备查的样本：样本量血站核酸检测样本的采集、运送和保存P48April16,2020检测前核对•状态•标识•接收时间离心后至检测前2-8°C保存不超过48小时血站核酸检测样本的采集、运送和保存P49April16,2020长期留样样本•理论上-80°C