血凝抑制试验

1血凝抑制（HI）试验简介（以禽流感病毒为例）一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。四、试验步骤1阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，269kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。210%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800r/min8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。（此步3可省略，直接配制1%红细胞）2.41%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入9mL生理盐水，混合均匀即可。（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清）3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1在微量反应板的1孔～12孔均加入25µlPBS（生理盐水），换滴头。3.2吸取25µl抗原加入第l孔，混匀。3.3从第1孔吸取25µl，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25µl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25µl弃之，换滴头。3.4每孔再加入25µlPBS（生理盐水）。3.5每孔均加入25µl体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。4表1：血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果12345红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集++++++++++-能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。4血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2在微量反应板的1孔～11孔加入25µlPBS（生理盐水），第12孔加入50µlPBS（生理盐水）。4.3吸取25µl血清加入第1孔内，充分混匀后吸25µl于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25µl弃去。4.41孔～11孔均加入含4HAU抗原25µl，室温（约20℃）静置至少30min。4.5每孔加入25µl1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件5下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6结果判定试验成立的条件：只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价大于或等于41og2为阳性。五、HI试验注意事项1、合理选择抗原和对照阳性血清。针对Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相应抗原和对照阳性血清。同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别。一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的HI效价较高。2、合理使用和保存抗原。反应试剂要按规定保存和使用，冻干的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存。要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。为避免反复冻融和细菌污染，可以无菌操作将试剂分装成小包装。3、反应温度不能太高。若在37℃（如温箱）下进行，6会影响检测结果。4、掌握好孵育时间。本操作中HA和HI试验中加入红细胞后的作用时间均为40分钟，主要是参照OIE标准，在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定(约25～30分钟)或4℃下孵育。一般来讲，主要看红细胞对照孔，对照完全沉淀时要迅速判读。5、标准抗原稀释液浓度必须为4个HA单位，必须每天制备并在试验前滴定。抗原标定方法血凝板12341、稀释液（µl）252525252、4单位抗原253、从第2孔开始倍比稀释到第4孔，最后一孔弃去说明1：稀释度1:21:41:81：16说明2：抗原滴度2倍1倍0.5倍0.25倍4、1%红细胞（µl）25252525微量振荡器混匀，室温放置40min,观察6、红细胞悬液要始终符合标准，使用时应随时振荡。7、反应体系为75µl。8、每次试验时均应设2个阳性血清对照、1个阴性对照。7阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。阳性血清的标定：具体操作可在购进一批标准阳性血清以后，取几瓶血清，溶解到一起，分成小包装，-70℃(无条件者可用-20℃)保存备用，每次用时取一小管。标定时取冻存血清1支，由几个操作人或分几次(红细胞等最好是分别配制)测定阳性血清效价，取平均值作为最终的标准阳性血清效价。大量检测时不需每板均做阳性对照，一般可在试验前、中、后分别设阳性对照。9、注意非特异性凝集素的消除。禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制试验时会出现2-3孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。可采用被调查的同种家禽的红细胞。也可采取56℃水浴30min，加入等体积的1%鸡红细胞，混匀，室温静置30min,1500-1800rpm,离心5-10min,取上清检测，结果判定时增加一个滴度。10、容易出现的错误。在进行试验操作时很容易出现错误，所以进行实验时一定要严格操作，每次测定应有严格的温度范围和作用时间，出现错误时要认真查找原因，以免类似错误再次出现。8以下是容易出现的错误：•（1）对照孔凝集•盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使没有血清抗体也能发生凝集反应。•当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。•血清变质或受细菌污染。•（2）全部凝集•当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。•抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。•生理盐水受细菌污染或其它因素。•（3）红细胞全部下滑•①当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。•②加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。•（4）温度对实验结果也有影响，一般要求在室温下进行实验，当实验温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。•（5）抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全；过长出现洗脱现象。