分子发光光谱法

第五章分子发光光谱法•某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量§5.1概述一、分子发光分析法及其分类•根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光源来激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法生物发光：以生物体释放的能量激发而发光荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高•荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级激发发射荧光强强激发光物质2.选择性好•不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长•不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长•比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广•具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。•荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法§5.2分子荧光和磷光的基本原理一、荧光和磷光的产生激发态分子在跃迁回到基态的过程中将多余的能量以光子形式辐射出来，这种现象称为“发光”激发单重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生自旋方向的变化。用S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态。激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的变化。用T1、T2分别表示分子第一和第二激发三重态。1.振动弛豫:它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移至低振动能级的无辐射跃迁过程。2.内转换:是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。3.系间跨越:不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子自旋状态的改变，如S1→T1。4.外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现象又称为“熄灭”或“淬灭”。S0S0S1S2T1λ2吸光内转换系间跨跃λ1吸光λ3荧光外转换λ4磷光振动驰豫荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时，去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个光子回到基态。磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。磷光的寿命比荧光的要长得多•从图中看出•磷＞荧＞激*易产生荧光n*易产生磷光二、激发光谱和发射光谱固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图，得到激发光谱曲线。选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或磷光光谱曲线。三、分子荧光参数1．量子产率又称荧光效率物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定：2．荧光寿命荧光寿命是指停止激发之后，荧光强度降到最大强度的1/e所需要的时间，常用τ表示。/0ttIIeI0，It分别表示在时间0和t时的荧光强度。利用荧光寿命，可以进行荧光混合物分析。•物质只有吸收了紫外可见光，产生*n*跃迁，产生荧光•*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大，寿命短•*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光•一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体三、荧光与分子结构的关系•具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强fex/nmem/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长1.共轭体系——有较强的荧光•芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光•多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定•3，4-苯并芘是强致癌物ex=386nmem=430nm2.刚性平面结构———较稳定的平面结构•具有强荧光的分子多数有刚性平面结构ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体C=CHHC=CHH3.金属螯合物的荧光•大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定•不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光•例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强NOHNOHM4.取代基的类型•对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团•由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱（3）影响不明显的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等(4)芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。(5)取代基位置——对位、邻位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。四、环境对荧光、磷光的影响1.溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大3.pH的影响•大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。•共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。OHO_OHH+_例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光•但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：—苯酚有荧光无荧光OHO_另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性。4.荧光猝灭（荧光熄灭）——荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂(i)碰撞熄灭碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂Q相互碰撞后，激发态分子以无辐射跃迁的方式返回基态，产生熄灭作用。碰撞熄灭将随温度的升高而增加；将随溶液黏度的减小而增大。（ⅱ）能量转移它是指处于激发单重态的荧光分子M*与熄灭剂相互作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下(ⅲ)组成化合物的熄灭它是指熄灭剂和荧光分子在基态时发生配合反应，生成不发荧光的配合物。(ⅳ)自熄灭和自吸收当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，这可能由于激发态分子之间的碰撞引起能量损失。假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠，由荧光物质发射的荧光，有一部分可能会被它自身的基态分子所吸收，这种现象称为自吸收。随荧光物质浓度的增加，自吸收现象将会加剧。五、荧光强度与荧光物质浓度的关系•用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系•If=fIa=f（I0-I）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器IIA0lgIf=f（I0-I010-A）=fI0（1-10-A）I=I010-A将上式展开]!3)3.2(!2)3.2(3.2[320AAAIIff]!3)3.2(!2)3.2(3.2[320AAAIIff•当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3fI0A=2.3fI0bc当A﹤0.05时，If与f、I0、和c有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、和b为常数，合并为KIf=KCIp=KC定量分析依据•荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。•浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成光源第一单色器液池第二单色器检测器放大器及记录器exem与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角I0§5.3荧光和磷光分析仪1、光源•激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽•荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源2、单色器大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱•第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长ex，用此激发光激发液池内的荧光物质ex。•第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长em。在选定的em下测定荧光强度，定量分析。3、样品池•盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4、检测器•把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度•荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。•荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度（二）磷光分析仪器•与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室•试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）•固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜•有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。（一）定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC1.标准曲线法——最常用的定量分析方法•将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。•以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标§5.4荧光和磷光分析及其应用2.荧光猝灭法•把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性•若荧光物质M与猝灭剂Q生成不发荧光的基态配合物MQM+Q=MQ（非荧光物质）经推导得出：)(1QCKIIf后前猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度)()()(QCMCMQCKfI前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量•与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线取相同荧光物质CMCMCMCM…CM加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…CQx(CQ0=0)测IfI前I后1I后2I后3…I后x计算I前/I后I前/I后1I前/I后2I前/I后3…I前/I后xCQxCQI前/I后xI前/I后3.比较法——比较简单•如果试样数量不多，可用比较法进行测量•配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液Ifx=KCx标准