BIOLOG

BIOLOG法微生物鉴定微生物群落结构主要功能OneTechnologyClinicalPlantDiseaseFoodIndustrialQCVeterinaryEducationMicrobialEcologyResearchBiolog’sFundamentalTechnologyWithaVastFamilyofApplicationsAndProducts应用领域检测原理BIOLOG公司独特创的碳源利用方法，以微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质反应导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异，与标准菌株数据库比较，即可得出鉴定结果。Biolog’sMulti-TraitTestFormatReductionofTetrazoliumViolet细菌和酵母的显色物质：四唑紫FilamentousFungiDatabase丝状真菌显色物质：INTDevelopmentoftheBiologMicrobialIdentificationSystemInitiallyScreenedOver500CarbonSources130SpeciesGNMicrobes65,000DataPointsBiologGNMicroPlateGN2MicroPlateGP2MicroPlateYTMicroPlateWellsWithTetrazoliumVioletWellsWithoutTetrazoliumVioletANMicroPlateFFMicroPlate功能一：微生物鉴定重点内容鉴定步骤软件应用鉴定实例维护保养疑难解答鉴定步骤分离纯化平板扩大培养制备菌悬液调整浊度接种培养获取结果分离纯化保证纯种是微生物鉴定的首要条件分离纯化采用常规微生物操作方法可以用国产培养基或自己筛选的培养基鉴定步骤总览BUG+B或TSA+BAirTypically30℃GN/GP-IF52%TGN2-150μl4-6,16-24BUG+B或TSA+BAirTypically35-37℃GN/GP-IF+T61%TGN2-150μl4-6,16-24CHOC6.5%CO2Typically35-37℃GN/GP-IF+T20%TGN2-150μl4-6,16-24BUG+BAir/6.5%CO2Typically35-37℃GN/GP-IF+T20%TGP2-150μl4-6,16-24BUG+M+TPLUSstreakingAirTypically30℃GN/GP-IF28%TGP2-150μl4-6,16-24BUA+BANATypically35-37℃AN-IF65%TAN-100μl20-24BUYAir26℃Water47%TYT-100μl24,48,72培养基培养环境培养温度接种液种类菌悬液浊度接种量培养时间GN-NENTGN-ENTGN-FASGP-COCCUSGP-RODGP-RODSBANYTOxi+TSI=A/AorK/AOxi－微生物好氧菌GNGP厌氧菌酵母菌2%MEAirTypically26℃FF-IF75%TFF-100μl24,48,72,96霉菌FFTSI=K/KorK/A说明1除嗜热菌外，其它均在26℃，30℃或35~37℃需要在巧克力培养基或需CO2的微生物，以及在BUG+B上形成的菌落小于1mm的微生物，为FAS(苛生菌)农业微生物不必在BUG培养基中加B(血)对于GN-NENT，如果A1孔阳性，则需在接种液加疏基乙酸钠对于GP-COCCUS,GP-ROD，如果A1孔阳性，接种液中除加疏基乙酸钠外，还需加水杨酸钠。说明2氧化酶反应：判断细菌是否产氧化酶，其产生的氧离子与氧化酶试剂(对盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺)反应生醌类物质，颜色变化为：粉红—紫色—蓝色—黑色TSI反应：用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(E.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。K/K—整支试管斜面红色K/Aw—斜面表面红色，底部浅黄色A/A—整支试管黄色K/A—斜面表面浅红色，中部和底部中黄色TSI(三糖铁)琼脂实验反应A/AA/KK/KK/Aw乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1遇酸变黄色硫酸亚铁铵、酚红、硫代硫酸钠志贺氏菌：能分解葡萄糖，产酸不产气，不发酵乳糖，不产H2S大肠杆菌：能分解葡萄糖，产酸产气，能分解乳糖，不产生H2S沙门氏菌：能分解葡萄糖，多数产气，不发酵乳糖，产生H2S，志沙大说明3：厌氧菌如果发现厌氧菌是革兰氏阴性杆菌，必须做卡那霉素药敏试验。如果抑菌圈≥10mm，说明此菌对卡那霉素敏感，为假设梭菌。如果无抑菌圈或抑菌圈10mm，说明此菌对卡那霉素不敏感，为假设拟杆菌和普雷沃菌拟杆菌和普雷沃菌其它厌氧菌从铝箔袋中取出，立即接种从铝箔袋中取出，曝露20min后再接种接种过程不能超过5min接种过程不能超过5min接种完后，等10min后再放入厌氧罐接种完后，等10min后再放入厌氧罐厌氧菌培养环境不能含氢气，因含强氢化酶的微生物在有氢气时会降解四唑类显然物质。厌氧菌培养20-24小时后，阳性孔应该有明显的紫色。一旦曝露在空气中，阴性孔也慢慢变成微弱的蓝绿色。如果在从厌氧罐中取出前发现存在蓝绿色，则说明厌氧环境有问题。返回常见疑难解答关键之一：菌悬液浓度Enterococcusmalodoratus(35%T)Enterococcusmalodoratus(20%T)关键之二：培养温度Staphylococcusxylosus(30°C)Staphylococcusxylosus(35°C)关键之三：消除菌块Bacilluslicheniformis(w/clumps)Bacilluslicheniformis(w/oclumps)关键之四：使用抗凝聚剂MicrococcusdiversusMicroLogrelease3.5MicrococcusdiversusMicroLogrelease4.0常见疑难解答1、为什么纯培养一定要用BIOLOG的培养基？答：由于培养基的营养决定微生物的代谢趋势，BIOLOG的数据库是用其特有的培养基建立的，故欲得到最佳的鉴定结果，务必在接种前一步使用厂家提供的培养基。有些用户说其筛选到的微生物在BIOLOG的培养基上长不出，必须用自己的培养基才能长出，这种情况十之八九这种微生物不包含在BIOLOG的数据库中，用户可以用自己的培养基做鉴定，但数据只能用于分析研究用。2、GN与GN2的区别？答：GN2是GN的升级板，GN与GN2的碳源完全相同，不同是营养基础，如无机盐、胶质等。3、微孔鉴定板的保存与质量鉴定？答：鉴定板应保存在2-8℃冰箱中。使用前应目测观察鉴定板的质量，一般微孔底部有微弱的黄棕色或粉红色印迹是正常的，如觉得质量有问题，可采用加水或菌悬液的方法进行检验，如果一加样品马上呈现明显的颜色，则可能碳源已经变质。另外可以采用ATCC标准菌株做验证试验。如果结果准确，则4、鉴定冻干种时需要如何处理？答：冻干种鉴定前应该用液体培养基连续活化2-3次，再进行纯培养。5、为什么一定要严格控制接种液的浊度？答：BIOLOG的鉴定原理与氧含量关系较大，而菌悬液的浓度又决定了氧的含量，而且其数据库是在一定的菌悬液浓度下建立的，为获得准确的鉴定结果，务必严格控制接种菌悬液的浊度。6、BIOLOG的浊度标准品是否与McFarland标准品有无可比性？答：BIOLOG的浊度标准品与Mcfarlands浊度标准品无可比性，BIOLOG标准品用于校准接种液的细胞浓度，它关系到鉴定结果的准确性。7、非肠道菌和肠道菌分别在30℃和35-37℃培养，可否用32-33℃的培养箱代替二者？答：微生物有其最佳的培养温度，如果采用上述方法，极可能得不到好的鉴定结果。8、手工读数时，如果有些微孔有些颜色，但不明显，如何判断？答：将颜色不明显的孔与A1孔比较，如明显深于A1孔，则判断为阳性。或者将其判断为边界值，即在进行数据库比对时不予以考虑。9、许多Microlog1和Microlog2的用户用自己的酶标仪读数，是否可行？读出的数据如何处理？答：用其它酶标仪读出的数据也是吸光度值，但必须通过一定的算法转换。也可根据A1孔的读数直接判断阴性或阳性。一般来说吸光度值小于0.2则判断为阴性，大于0.2则判断为阳性，这是一种粗略的判断方法，如需准确判断，应采用陈列图方法，确定边界值，将干扰的反应排除，才能得到较佳的结果。10、有些用户单独购买微孔鉴定板用于研究，对获得的数据如何进行分析？答：一般这类用户多用鉴定板做微生物群落分析和营养特性研究，其接种的菌悬液甚至是混合菌液，如有BIOLOG的软件，可采用Cluster分析功能模块，对不同试验的结果进行比较。也可用PCA软件(主要化合物分析)或CLPP软件对数据进行分析，这两种软件由其它公司提供，可以在网上找到，但需支付一定费用。13、BIOLOG数据库中的放线菌包含在哪一类数据库中？答：放线菌的数据库主要包含在细菌的数据库中。11、鉴定细菌时，如果4小时鉴定的结果与16-24小时的结果不同，该如何判断结果？答：一般这种情况多数是菌种不够纯造成，或接种过程污染严重。如果这两种情况都排除仍存在这个问题，则选取SIM值大的做为最佳结果。12、质控套装有何用处？哪些客户需要它？答：每套系统在出厂时已经做过严格的质控鉴定，一般用户无需在首次安装时购买质控套装。对于一些要求较高且预算允许的情况下，如药厂、医院等单位，则要求最好做质控工作。另外，仪器使用较长时间后，对读数仪和浊度仪进行校准后，最后用质控套装确认仪器的性能。结束操作过程实例BIOLOG微生物鉴定操作步骤以革兰氏阳性芽孢杆菌的鉴定为例接种至鉴定板，培养调整浊度制备菌悬液接种至BUG+M+T平板纯培养制备BUG+M+T平板术语前言读取结果返回OVERVIEWMainmenuGram-positive,spore-formingBacilli(GP-RodSB)havetraditionallybeendifficulttospeciate.Theybegintosporulatewithinminutesofbeingintroducedinagrowth-limitingmedium.Sporulationslowstheorganismmetabolism,whichresultsinlossofactivityonbiochemicaltestmedia.Theygrowreadilyonenrichedmedia,buttendtoclump,slime,harden,becomegrainy,andformpellicles(skin-likefilms).Thesefactorsmakeitdifficulttoprepareuniformsuspensionsforidentificationincommercialtestkits.Youcanusetraditionalbiochemicals,butthismeanshavingalltheneededbiochemicaltestmediaandreagentsonhand.Italsousuallytakesmoretimetosetupandinterpretallthebiochemicalsv