胚胎实验室操作手册

附件6-01胚胎实验室操作手册第一节胚胎实验室每日工作流程第二节胚胎实验室安全与质量控制一、实验室安全与感染控制实验室必须有完善的安全制度和防患措施，必须有关于火、电意外引起紧急情况时的应急方案，实验室人员必须了解灾情中的救援措施。为避免停电影响设备正常运转，应备有双重供电系统，或不间断电源（UPS），以确保二氧化碳培养箱和显微镜等关键设备在意外停电时满足正常工作。1.所有体液样本（精液、血液、卵泡液等）必须视同潜在污染源，所有的供体组织和体液应有适当的传染病监测。2.实验室工作人员应清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接种。3.特别小心不要被那些受体液污染的仪器或设备意外损伤。4.避免将体液溅到眼中。5.当接触体液或盛放体液的容器时，应带一次性无粉橡胶或塑料手套。离开实验室时，将手套脱下丢掉，决不可重复使用。6.离开实验室时，脱掉实验室衣服，不能穿着出入公开场所或餐厅。7.被体液沾染时，必须马上用消毒液或肥皂清洗。8.接触配子和胚胎的耗材必须使用一次性用品。9.因体液溢出污染实验室设备时，应在操作完成后用75%酒精消毒。10.在实验室体液操作中必须使用机械抽吸装置，禁止用口吸。11.所有操作步骤和体液处理应小心，尽量减少浮滴和烟雾生成。例如离心时必须用带盖的试管。12.实验室中严禁吃东西、吸烟等。13.所有丢弃的体液和用后的一次性物品必须按污染物品处理。二、实验室质量控制(一)培养箱的质量控制专人管理，每日确认以下各项内容并予以记录：1.CO2的控制：6%±0.2%；2.温度的控制：37℃±0.2℃；3.湿度：大于80%RH，水盘内水的深度始终保持在大约1cm以上。培养箱内的水盘使用超纯水，根据不同培养箱要求定期更换，换水当天培养箱不放卵子或胚胎；4.培养箱显示器温度与培养箱内温度计的温度应一致。不一致时应及时调整校正。5.消毒清洁：每隔3个月消毒培养箱。消毒时拆卸培养箱内所有钢架，以75%酒精和超纯水分别擦拭消毒，再送高压消毒。培养箱内壁以75%酒精和超纯水分别擦拭。消毒清洁完成后，需开机运行稳定后方可使用。(二)培养用气体的质量控制1.使用有合法资格的气体供应厂家，气瓶使用前需检查是否有合格证标签。2.使用医用高纯度CO2（99.995%以上）培养胚胎。每天记录气瓶的压力，定期检查气瓶有无漏气并更换培养箱外气体过滤器。3.CO2进入培养箱之前，必须经过CODA过滤器对CO2进行过滤。CODA过滤器应定期更换，根据供气量，每3-6个月更换一次。4.CO2分压应与培养箱要求的压力相符，当气瓶CO2气体接近用完时，应及时更换新的气瓶，记录更换气瓶时间。(三)UPS的质量控制重要仪器如培养箱、显微镜、冰箱等必须连接到UPS上，每日观察UPS工作状态，如有异常及时找工程师维修。(四)液氮罐的质量控制1.胚胎冷冻液氮罐需每天查看外观，每周至少两次检测剩余量，按时添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。2.液氮运输罐需专人更换。3.液氮罐应存放于固定位置。4.液氮罐应每3年进行一次校验。(五)超净工作台的质量控制1.超净工作台层流系统提供洁净环境，用于胚胎培养的准备工作，如培养液配制、培养皿准备、胚胎操作等，不能进行其它存有污染性的操作。2.超净工作台应于每天工作前提前30分钟开启，台面温度应稳定于设定的温度。3.超净台每年应至少检测一次洁净度。(六)实验室层流系统的质量控制1.体外受精实验室温度维持在24±2℃之间，湿度在40%以上，每日观察并记录温度和湿度，如果波动过大及时进行调整，若有异常，尽快维护和处理。2.在有胚胎的情况下不能关闭实验室净化空调系统。3.实验室净化空调系统由专业人士检测维护，新风口滤网每2-4周更换一次，回风口滤网每月更换一次，初效过滤器每1-3个月更换一次，中效过滤器每3-6个月更换一次，高效过滤器每1-2年更换一次，并做好维护检测记录。如遇特殊情况，及时更换。4.每日观察并记录胚胎实验室与冷冻间、缓冲间、移植手术室及取卵手术室之间的压差。如果压差＜5Pa，应查找原因，及时检修和维护。5.每月进行实验室空气细菌培养。(七)冰箱的质量控制专人管理，每天检测并予以记录。1.冷藏层：28℃；2.冷冻层：-15-20℃。(八)热台的质量控制专人管理，每天操作前检测并予以记录。要求：38℃±0.5℃。(九)实验室仪器设备的使用和维护1.建立设备常规操作程序，并严格按照操作程序执行。2.保存各种设备的使用说明文件。3.仪器设备的维修保养应严格按照规定的程序进行，有关人员在进行保养、调校和维修工作以前，应首先熟悉仪器的性能、结构、使用方法和保养、调校方法，以及维修程序。4.仪器设备一旦出现异常或发生故障，使用人员应立即关机观察，防止事故扩大，及时向实验室负责人或中心负责人汇报，然后通知修理人员组织维修。5.定期由专业技术人员对仪器、设备进行校验，建立设备使用档案。(十)培养基、耗材管理试剂和耗材的订购应选择国内同行公认的有资质的公司和品牌。1.培养基管理（1）登记：培养基到货时需立即清点、核对、记录到货时间、试剂名称、编号、批号、数量、收货人等，并注明冷藏品到货时，包装和储存条件是否达到要求。（2）保存：所有培养液在规定条件下保存至有效期。试剂分装后在各分装容器上做明显标志，标明名称、有效期、分装时间，并用封口膜密封容器口。（3）使用前准备：培养液使用前必须过夜平衡。平衡方法：使用前一天下午根据需要放入37℃、6%CO2培养箱平衡备用；含MOPS的培养基放入不通CO2气体的37℃培养箱内平衡备用。（4）保质期：矿物油及培养基在有效期内使用。2.耗材管理（1）耗材到货时需立即清点、核对，记录到货时间、名称、编号、批号、数量、收货人等。（2）使用前必须检查有效期和包装是否完好无损，不使用过期用品及包装破损用品。所有耗材送至实验室之前，必须用75%乙醇擦拭外包装，待75%乙醇挥发后放入物品柜。（3）对产品质量有疑问时，立即停止使用并报告质控科。（4）每季度清点各种耗材，及时补充并合理安排使用。（5）不同批号的耗材需要通过精子存活试验后方可使用。(十一)人精子存活试验使用上游法处理精液，获得活动良好的精子，调整精子浓度为5×106/ml，取0.5ml精子混悬液，在待测物品中放置一段时间（3－5分钟），如吸管、移液管、针管等在精子混悬液中反复抽吸后，再放入5ml试管内，作为实验管。另取0.5ml精子混悬液置于另一试管中，作为对照管。将实验管和对照管置于室温，每24小时用Makler计数板计数实验管及对照管内的活动精子比率，并计算48小时的生存指数。生存指数＝实验管内精子活动率/对照管内精子活动率。正常生存指数应大于85%。如果小于85%，应考虑可能有细胞毒素的存在。接触配子与胚胎的一次性耗材应经过人精子存活试验，证明无毒方可使用。(十二)实验室数据指标的定期回顾总结每月统计实验室的各种数据，进行分析和检查。实验室质量达标标准：1.受精率：IVF≥65％；ICSI≥70％；2.卵裂率：≥90％；3.优质胚胎形成率：＞50％；4.冷冻周期率：30-50％；5.卵裂期胚胎冷冻后的复苏存活率：≥90％。如没有达到上述正常标准，须查找原因，及时改正。(十三)实验室组织管理和质量监督1.实验室工作人员除进行配子的处理和培养外，还要进行一系列的常规质控监测，意外事件的详细记录和相应对策的结果评估。实验室管理人员必须按实验室的质量保障体系执行，明确实验室的各个环节，严格遵循质量安全程序、标准化的操作方法。2.应定期对实验室每位成员进行质量监督，避免由于仪器、试剂、个人操作引起的偏差。对于受主观因素影响较大项目，应该进行内部质量控制检查，对实验室工作人员的操作的准确性和精确性进行评价。此外，每个实验室工作人员应接受医学继续教育，学习最新的生殖医学知识。(十四)中心常用试剂、耗材一览表本生殖医学科目前鼠胚实验常规使用VitrolifeG5系列培养基。试剂名称作用货号VitrolifeG5系列G-MOPSTMG-MOPSTMPLUS在室温、大气环境中处理、操作卵子和胚胎K021893非CO2依赖型培养液G-IVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G-1TMPLUS卵裂胚培养液原核期、D2、D3胚胎培养K022244G-2TMPLUS囊胚培养液囊胚培养K021890HYASETM，透明质酸酶消化、移除卵丘细胞K000627ICSITM，PVP精子制动K043116OVOILTM，培养用石蜡油避免液体挥发和污染K991351SpermRinseTM洗精液精子处理：洗精K000621SpermGradTM梯度离心液精子处理：梯度离心K023403其它试剂Quinn’s精子冷冻液精子冷冻保护剂ART-8022SIGMAEBSS缓冲液取卵、移植冲洗液E2888KITAZATO玻璃化冷冻液胚胎冷冻VT101KITAZATO玻璃化解冻液胚胎解冻VT102耗材耗材名称规格货号Falcon35mm培养皿500/case353001Falcon中心井培养皿500/case353037FalconICSI皿500/case351006Falcon5ml试管500/case352003Falcon14ml试管500/case352001Falcon15ml离心管500/case352095Falcon取精杯（样品杯）100/case354013Falcon1ml移液管1000/case357521Falcon2ml移液管1000/case357507Falcon10ml移液管200/case357551Falcon四孔板100/case353654NUNC四孔板120/case176740SIGMA巴氏吸管25/caseS6143德国HIGENBERG吸管26/caseParafilm封口膜1/case13-374-16Millipore针头滤器0.22um加藤冷冻叶片10个/包玻璃化冷冻载杆冷冻用铝支架MTG16965/6000冷冻套管MTG16912/0133PALL气瓶滤器0.20m4251HUMAGENinjection针10/盒MIC-35-30HUMAGENholding针10/盒MPH-MED-30COOKICSI针10/盒COOKholding针10/盒BD1ml注射器100/case300771三、实验室应急预案(一)实验室火、电应急预案实验室内应配置灭火器。实验室内的主要设备，如显微镜、培养箱、冰箱等均连接UPS，保证电压稳定，并且在意外断电情况下可提供6－8小时的电力供应。(二)设备紧急故障1.CO2培养箱：至少三台备用，每日监测，一旦出现故障，立即报修，并暂时以正常运行的培养箱替代故障培养箱。2.热台：定期检测，一旦出现故障，立即报修。3.显微镜：准备灯泡与保险丝的备件，出现故障时及时更换。其它故障立即报修。4.液氮罐：应始终备有状态良好的备用液氮罐。对现用液氮罐进行定期检测，一旦发现异常泄漏，立即转移故障罐内的胚胎或精子。5.CO2钢瓶：定期检测气压，及时更换。常备至少一瓶CO2。6.冰箱：每日监测，一旦出现故障，立即报修，并立即转移冰箱内物品。(三)实验室环境按常规进行监测，温度由层流空调机组调控，发生故障立即报修；若空气细菌培养结果超标，立即清洁实验室，并重新进行空气培养。(四)一次性耗材按常规进行质控，一旦出现异常，立即更换批号。四、实验室新人培训计划1.实验室技术人员必须具备医学或生物学专业本科以上学历，并掌握系统的临床胚胎学知识和细胞培养技能。2.实验室技术人员应在卫生部批准的人类辅助生殖技术培训基地进修至少3个月。3.理论学习：卫生部【176】号文件，人类辅助生殖伦理原则，实验室质控，基础内分泌、遗传学理论，人类卵子、精子发生生理，精子获能，IVF、ICSI适应症，卵子形态与成熟度，胚胎序贯培养系统，精子、胚胎冻融原理，ICSI安全性等。4.实践练习：练习拉管、装针、模拟拾卵、吹打去除颗粒细胞、少弱精子的分离处理。练习ICSI精子制动、吸打、定点停位，模拟卵子注射。5.独立工作：在本中心上级技师督导下完