三酶促反应动力学

第三节酶促反应动力学内容一、引言二、反应级数和速度常数三、单底物酶促反应动力学四、多底物酶促反应动力学五、酶催化反应的抑制动力学六、影响酶催化反应的因素一、引言酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影响酶促反应速度的因素包括[S]、[E]、[P]、[I]、[A]、pH和温度等。阐明反应机理计算反应时间、最佳反应浓度，设计合理反应器二、反应级数和速度常数1.反应级数V=[A]m[B]nm+n2.零级反应:反应速度与底物的浓度无关。当[S]大大高于[E]时，可认为是零级反应。0][][ktdPdtdSdVtdkSdPd0][][ttSStdkSd00][0][][tkSSt00][][tkP0][3.一级反应反应速度与底物浓度成正比（单底物反应）,当[E]〉〉[S]时为一级反应。][][1SktdSdVtdkSSd1][][ttSStdkSSd01][0][][][tkSSt10][ln][lntkSSt303.2][][lg104.二级反应反应速度与两个反应物的浓度成正比两个相同的反应物反应生成产物（2S→P）两个不同的反应物反应生成产物（A＋B→P）。2S→P222][]][[][SkSSktdSdVtdkSSd22][][02][1][1StkStA＋B→P[A]=[B]，与第一种情况的推导和结果相同。[A]〉〉[B]，反应速度只与[B]成正比，其动力学方程式与一级反应的相同。这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应。]][[][][2BAktdBdtdAdV三、单底物酶促反应动力学1.反应初速度的测定2.中间产物学说3.米氏方程4.米氏方程的讨论1.反应初速度的测定随着酶反应的进行，酶反应速度会逐渐变小。为了排除底物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，采用酶反应的初速度作为衡量的指标。从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从近0处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切线无法作准确。实际使用的初速度测定方法1.1.高底物浓度测定法,零级反应近似法。必须在无高底物浓度抑制时才适用。1.2.低底物浓度测定法,一级反应近似法。在不同[S]时测定V，以V对[S]作图，直线部分的斜率为。在直线部分，[S]乘以得V。mmKVmmKV1.3.使用不同酶量的测定法在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。2.1问题引出1903年Herry研究反应蔗糖葡萄糖+果糖时发现如下现象：以酸为催化剂以蔗糖酶为催化剂vvss2.中间产物学说2.2中间产物学说ESP12-1kkkESESEP1913年Michaelis和MentenVmax[S]Ks+[S]v=3.米氏方程Michaelis-Mentenequation3.1推导假设：a；反应过程中酶浓度恒定，[Eo]=[ES]+[E];b底物浓度远大于E浓度，所以[S]-[ES]≈[S]；c．在反应初速度条件下，产物P浓度低，不考虑第二步反应的逆反应。PEESkp][快速平衡法(k2k-1)迅速平衡第二步慢稳态法1925年，Briggs和Haldane酶催化反应的k2很高Haldane公式3.2Km和Vm的求法1)Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）maxmax111SKm可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。SKm，直线基本上是水平的,-1/Km则难以测得。[S]在3.3～20Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。[S]Km，则直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。[S]在0.033～0.2Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。⑴点分布不均匀，集中于1/v轴，不过，此缺点可通过适当选择[S]克服。⑵误差放大。在低[S]时，v很小，本身容易产生误差；而化成1/v与1/[S]后，误差显著放大。V1S1Km1Vmax12、其它线性作图法1).Hanes-Woolf作图法优点：点分布均匀；缺点：由取1/v，使误差放大，但比较一致2).Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法3).Eadie-Scatchard作图法无误差放大，可信度高3.3米氏方程的积分形式一般：零级：一级：应用：建立t~X关系求Km、Vm011ln1KmtSXVmXVm1ln1KmtVmX0SXtVm4.米氏方程的讨论4.1米氏常数的意义a.当时，Km=[S]Km是酶催化反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。b.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。c.同一种酶有几种底物就有几个Km值。d.Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。max21V4.2反应规律a.当[S]》Km时，≈Vmax，零级反应，反应速度与底物浓度无关，表明酶的活性中心已全部被底物占据；b.当[S]《Km时，≈，一级反应，反应速度与底物浓度成正比；c.当[S]处于两者之间，为混合级反应。][][maxSKmSV][][maxSKmSV][maxSKmV4.3米氏方程的实际用途计算V达到Vm的百分率，要达到一定的，需要的[S]确定一定X时的反应时间寻找天然底物判断在细胞内酶是否受[S]的调控mVV判断在细胞中酶催化反应的主要方向寻找限速步骤米氏方程的应用范围单底物单结合位点酶催化反应酶具有多个结合位点，且相互之间不发生相互作用多底物反应中，只有一种底物浓度发生变化，其它底物浓度保持不变适用范围多中间步骤的催化反应E+SES1ES2E+P较复杂反应历程的催化反应稳态前动力学存在逆反应的酶催化反应高底物浓度抑制与活化高酶浓度四多底物酶促反应稳态动力学按底物数分类的酶促反应底物数酶分类催化反应酶种类占总酶%说明1.单底物异构酶A↔B5%真正单底物2.单向单底物裂合酶A↔B+C12%逆向反应是双底物反应3.假单底物水解酶A-B+H2O↔A-OH+BH26%[H2O]可视为常数4.双底物氧化还原酶基团转移酶AH2+B↔A+BH2A2++B3+↔A3++B2+A+BX↔AX+B27%24%5.三底物连接酶A+B+ATP↔AB+ADP+PiA+B+ATP↔AB+AMP+PPi5%1.Cleland命名和表示法1963年建立的多底物、多产物酶促反应动力学统一命名方法和表示反应历程的原则。2.双底物酶促反应类型通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。A＋B→P＋QE反应过程是否形成三元复合物连续机制乒乓机制2.双底物酶促反应类型2.1连续机制：反应过程中形成三元配合物，分为序列有序机制依赖NAD＋或NADP＋的脱氢酶的反应就属于这种类型。序列随机机制：某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。ABPQEEAEQEB(EAB----EPQ)EPEBAQP2.2乒乓机制：不形成三元配合物转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制APBQE(EA—EP)F(EBEQ)E3.双底物反应的动力学双底物连续反应动力学按快速平衡法，如果k4、k5k－1、k－2，则总反应的限速步骤为EAB的生成，故可将反应模式简写成：]][[][]][[BAAKKKBAVVmBmBiAm][]][[EABBEAKmB][][][EABBKEAmB][]][[EAAEKiA][][][EAAKEiA][]][[][EABBAKKEmBiAa．当[A]固定，[B]可变时，速度方程可写成：][][][BKAKKBVVmBmBiAm][][1][BAKKBVViAmBmb．当[B]固定，[A]可变时，速度方程为][][][][][ABAKBKKAVVmBmBiAm][1][][][BKABKKAVmBmBiAm][][1][][][1ABKBKKABKVmBmBiAmBm][][][][1AKBKKABKVVmBmBiAmBm讨论a．固定两种反应物中的任一种，都可以使速度方程写成米氏方程的形式；两种反应物浓度都变化时，则不为米氏方程的形式。b．当[A]固定，[B]可变时，[A]影响表观米氏常数，不影响最大反应速度。c．当[B]固定，[A]可变时，[B]既影响表观米氏常数，又影响最大反应速度。作图法求动力学参数a.[A]固定，[B]可变时,双倒数作图此直线的横轴截距＝miAmmBVBAKVKV1][1][11][11AKKiAmB斜率对再作图横轴截距＝][1AiAK1b.[B]固定，[A]可变时双倒数作图][11][1][1BKVABVKKVmBmmmBiA纵轴截距对再作图横轴截距＝][1BmBK1区分连续机制和乒乓机制五酶催化反应的抑制动力学1.基本概念2.可逆抑制作用3.不可逆抑制作用1基本概念1.1.降低酶促反应速度的因素（1）失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。（2）抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。1.2.抑制作用及类型抑制作用抑制剂抑制类型A.可逆抑制作用（reversibleinhibition）抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。B．不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）抑制剂与酶以共价键结合，用上述物理方法不能除去抑制剂和恢复酶活性。1.3.抑制程度的表示a.相对活力分数（残余活力分数）a=Vi/Vob.相对活力百分数（残余活力百分数）a%==Vi/Vo*100%c.抑制分数，指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vod.抑制百分数i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100%水酶水底物和抑制剂图1一水先混合的抑制剂和酶等量底物图2一1.4.可逆抑制和不可逆抑制作用的鉴别方法1方法1无抑制剂时，有抑制剂时，在有抑制剂时Vm对酶量（[E]0）作图时，得一斜率较小的直线。][]][[EIIEKi][][][0EEEI][][]][[0EEIEKi][][]][[0EKEKIEii0][]][[][EKEIEKii0][][][EKEIKii][][][0IKEKEii0][EkVcatm0][][][EIKKkEkViicatcatm方法22、可逆抑制作用reversibleinhibition抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可用透析法除去抑制剂，恢复酶的活性。类型①竞争性抑制作用②反竞争性抑制作用③非竞争性抑制作用④混合型抑制作用2.1竟争性抑制作用(competitiveinhibition)：反应历程E+SESE+Pk1k-Ikp+Ik2k-2EI动力学方程及曲线][)][1(][maxSKiIKmSV讨论:a最大反应速率不变，米氏常数变大；bI增大，抑制作用增大；cKi小，抑制作用强。问题：增大底物浓度，对抑制作用有何影响？动力学常数双倒数作图法Hanes-Woolf作图法求Ki值以双倒数图的斜率对[I]作图Km＇对[I]的再作图Dixon法求Ki值在Dixon作图中，以斜率对1/[S]再制图，可得一通过原点的直线，这充分证明抑制剂为竞争性的。竞争性抑制作用举例某些药物或体内代谢物对酶的竞争性抑制作用药物（抑制剂）被抑制的酶竞争底物临床应用及机理磺胺药二氢叶酸合成酶（细菌）苯