果蔬农药残留快速检测技术

果蔬农药残留快速检测技术农业部食品质量监督检验测试中心（石河子)食品安全问题概述一食品安全问题（一）名词含义1食品安全是指食品中不应含有任何可能损害或威胁人体健康的有毒、有害物质或因素。食品安全是食品卫生的重要组成部分。2食品安全性是指食品按其原定的用途进行生产和/或食用时不会对消费者造成损害的一种担保。3食品安全问题是指食品按其原定的方法食用时可能损害或威胁人体健康的物质或因素。（二）农产品安全指标农产品的安全指标主要包括以下内容：1、严重危害人体健康的指标，如致病菌、毒素、贝类毒素；2、农产品污染指标，包括化学和微生物污染指标，如农药残留、兽药残留、重金属、细菌总数、大肠菌群等；3、农产品掺杂使假，如甲醛、三聚氰胺、增白剂、防腐剂、着色剂等，4、转基因产品的安全性。（三）农产品安全问题目前的研究成果表明，农产品安全主要存在以下几方面的问题：1生物毒素生物毒素主要指生物自然产生的毒素，主要包括：（1）贝类毒素种类：麻痹性贝类毒素（PSP）腹泻性贝类毒素；(DSP)特点：加热不易被破坏，所以其危害性相当大。PSP存在：PSP存在于世界各处，龙虾和许多蟹类体中发现PSP毒素。临床症状：该毒素会引起神经系统的疾病，包括颤抖、兴奋及唇舌的灼痛和麻木感，严重时会导致呼吸系统麻木以致死亡，是一种可致命的毒素。DSP存在：DSP在加拿大、亚洲、新西兰、欧洲等地区的贝类生物体中发现。临床症状：PSP毒素可引起轻微的胃肠疾病，但不是一种可致命的毒素。（2）真菌毒素真菌毒素，有时也俗称霉菌毒素，是某些真菌的代谢产物，目前已发现的真菌毒素有十多种，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马霉素等，常见的产毒真菌多为曲霉、青霉和镰刀霉。（注意：在发霉的菌株中，不一定都存在有真菌毒素。真菌毒素有时从表面上不一定能观察到有霉变的现象，两种者之间不存在必然的因果关系）真菌存在于大多数的农产品中，真菌毒素直接或间接进入食物链会导致动植物食品受到毒素污染。在众多真菌毒素中，黄曲霉毒素是众所周知的最危险的毒素之一，是一类强致癌物。它是一组化学结构类似的物质，目前已鉴定出12种，B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中B1毒性最强。2转基因农产品的安全性转基因农产品的含义为：农产品中含有转基因生物成分或者利用转基因生物，如转基因植物、动物或微生物生产的农产品目前还没足够的证据证明转基因食品是否对人类无毒、无副作用，人们对转基因产品与非转基因产品是否有着“实质等同”、有无显著差异，还存在疑虑。目前，世界上较为一致的观点是生物技术产品（转基因产品）对人类健康和生态环境具有潜在危险。3化学性物质危害化学性物质的危害主要包括五个方面：⑴化肥我国是世界上化肥施用量最大的国家。氮肥（纯N）年使用量2500多万吨，单位面积施用量为世界平均水平的3倍。肥料施用不当、滥用化肥生产的蔬菜对人体健康的威胁不亚于在蔬菜上残留的农药。这是因为硝酸盐本身对人体无害，但是它可在土壤、人的口腔和胃中转化为亚硝酸盐，其对人体有危害。亚硝酸盐危害主要表现在两方面：A：大量聚集可能引起中毒，长期摄入，可引发消化系统癌变，如胃癌、肠癌等；B：NO3-+NO2-+胺类化合物→亚硝胺（高致癌物）⑵重金属危害镉、汞、铅、砷、铬的危害为：在人体有蓄积性，半衰期较长，能产生急性或慢性毒性反应，可能导致畸形，致癌和致突变的潜在危害。危害高低依次为：镉、汞、铅、砷、铬。目前我国儿童金属铅污染较为严重。⑶农药残留危害我国是世界农药施用量最大国家，年施用量超过130万吨，单位面积施用量为世界平均水平的2倍.我国与欧美等发达国家相比，农药生产、使用存在较大的差距。主要表现为高毒农药使用量占多数,具体表现在以下两个方面：A：使用农药仍以杀虫剂为主，占总用量的68%；B：在杀虫剂中，有机磷农药占70%以上。我国每年因农药中毒事件屡屡发生，特别是蔬菜中有机磷农药中毒更为突出。水果、蔬菜中有机磷农药被人体吸收后通过血液运到人体的各个脏器,损害脏器.中毒表现:出汗,肌肉颤抖,心跳加快,瞳孔缩小等.⑷添加剂主要表现在:①过量添加着色剂、护色剂、去色剂、防腐剂等,如苯甲酸、山梨酸、亚硝酸盐、亚硫酸盐等。②还有无知或违法掺假，如甲醛、苏丹红、吊白块、三聚氰胺等等。⑸兽药药残兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及/或其代谢产物，以及与兽药有关的杂质的残留。兽药残留的类型包括：1、原药；2、药物在动物体内的代谢产物；3、药物或其代谢产物与内源大分子共价结合的物质。药残是在畜禽和鱼养殖过程中，为了预防和治疗而使用的抗生素、磺胺类等化学药品，它们往往造成药物残留于食品动物组织中。药残通过食物进入人体内。动物性食品中的药物残留对人类健康的影响，一直是一个众说纷纭的问题。以前，人们普遍认为药残增加人体的抗药性和耐药性细菌种群的增长，将增加潜在的安全问题。但近期的研究表明，有效抗生素是致癌物质，人体过量食用，将导致细胞癌变。禁用兽药：盐酸克伦特罗、莱克多巴胺。二农产品质量安全的相对性不论人类知道与否，任何农产品中或多或少都存在对人类健康有害物质，绝对安全的农产品是没有的；同时，农产品中所含的有害物质的量很少，且在正常范围内时，其不会对人体健康造成危害，因此，农产品安全是相对的，而不是绝对的。人类可做的是一方面研究认识农产品中的有害物质；另一方面则是尽其所能减少或消除农产品中有害物质的存在，吃上安全的农产品。三农产品质量安全快速检测方法的特点及分类（一）农产品质量安全快速检测的特点农产品快速检测简单地说就是当试剂采购准备好后，从试剂配置开始，包括样品处理时间，能够在几分钟或十几分钟内得到检测结果是最理想的，但是这种方法目前还较少，我们所说的快速检测是个相对概念，即与常规检验或传统方法比较能够缩短1/2或1/3的时间就可得到检测结果的方法，就可认为是较快的方法了。快速检测主要从三个方面体现：1实验准备简单，使用试剂较少，2样品经简单处理后即可测试，或采用先进快速的样品处理方法，提高样品处理效率。3简单、快速和准确的分析方法，能够对处理好的样品在短时间内检出结果。（二）农产品质量安全快速检测方法的分类农产品质量安全快速检测技术始于上世纪50年代，经过50多年的发展，特别是近20多年的快速发展，检测技术已含盖农产品安全的各个方面，快速检测方法已达百种以上。这些方法按不同的指标可分为不同的种类。目前，主要有下列几种分类方法：1按场地可分为：①现场快速检验②实验室快速检验2从定性定量来分：①定性快速检验（多在现场）②半定量快速检验（多在现场）③定量快速检验3按检测原理分：①活体生物测定法-发光细菌或敏感性家蝇②分子生物学法③生物化学测定法④化学法—有机磷农药速测灵法，气谱法四.农产品质量安全快速检测技术发展的现状(一)农产品质量安全快速检测技术发展现状(二)我国农产品质量安全快速检测技术发展现状农产品质量安全快速检测方法的研究受到各国政府的高度重视，因而成为当前研究的热门课题之一。成熟的水果、蔬菜农药残留检测方法主要有下列几个方面1化学法该方法是以气相色谱法为代表的经典分析方法。特点：灵敏度高、准确，可对几乎所有农药残留进行定性和定量检测，但测定时间周期较长，成本较高，操作复杂，不适合市场抽查和监督管理。2生物法⑴活体生物测定法用发光细菌或敏感性家蝇作为测定材料；⑵分子生物学法采用免疫反应，如酶联免疫反应，采用特异性的酶联免疫试剂盒；⑶生物化学测定法生物化学测定法是利用胆碱酯酶抑制原理，使用仅限于能抑制胆碱酯酶活性的农药。目前我国成型的农药残留快速测定方法1农药残留试纸法（农药速测卡法、酶试剂法或STRIP法）2酶片法（农药速测卡法）3农药残留分光光度法（抑制率法）4酶联免没试剂盒法---分子生物学方法5有机磷农药速测方法果蔬农药残留速测技术－酶抑制率法•一.检测原理•1.酶的特性（胆碱酯酶）•⑴选择性•酶的分解和合成具有专一性。⑵活性•指酶在常态下，能完成物质的合成或分解⑶适宜的条件•PH＝8温度37-38℃2乙酰胆碱酯酶的酶促反应•酶+底物(硫代乙酰胆碱)→硫代胆碱+乙酸•乙酰胆碱酯酶+拟除虫菊酯类等农药→酶活性不被抑制•酶显色剂•底物――→分解产物――――→黄色溶液3存在有机磷或氨基甲酸酯类农药的酶反应•乙酰胆碱酯酶+有机磷或氨基甲酸酯类农药→酶活性被抑制•显色剂•酶――→无分解产物―――→无色溶液•底物――――→∣显色剂•(硫代乙酰胆碱)――→少量分解产物―――→浅黄色溶液•→活性被抑制→含有机磷或氨基甲酸酯类农药•底物+丁酰胆碱酯酶+样本――•→活性正常→不含有机磷或氨基甲酸酯类农药4.原理•在一定条件下,有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的正常功能有抑制作用,其抑制率与农药的浓度呈正相关.在正常情况下,酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解,其水解产物与显色剂反应,产生黄色物质,用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值,计算出抑制率,通过抑制率可以判定出样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在.二检测范围及灵敏度1检测对象蔬菜：叶菜、果菜、豆菜、瓜菜等（除胡萝卜、韭菜、葱、蒜、茭白、蘑菇等）水果：苹果、梨、桃、草莓等。2检测农药的范围•农药:A：有机磷类•甲胺磷、对硫磷、氧化乐果、甲拌磷、久效磷、敌敌畏、杀扑磷等（灵敏度0.5-5mg/kg•甲基对硫磷、水胺硫磷、甲基异硫磷、毒死蜱、乐果等（灵敏度8-10mg/kg）。•B：氨基甲酸酯类：•克百威、涕灭威、灭多威、丙硫克百威、丁硫克百威（0.2-2.5mg/kg）。三试剂的配制和保存1.专用酶(乙酰胆碱酯酶)•配制：根据酶的情况,用缓冲液溶解.注意:酶液的活性应为ΔA0＞0.3以上•保存：粉状的酶(密封)应储存在冷冻室内用时用提取液溶解，溶解后的酶液分成2-4小瓶，暂时不用的储存在冷冻室内，用时解冻，用后的酶液储存在冷藏室（0-5℃）内，在四天内用完，酶液反复解冻最多不能超过两次，否则会影响酶的活性。2.底物(硫代乙酰胆碱)配制：取25mg底物,加3.0mL蒸馏水溶解,摇匀后置4℃冰箱内保存.保存期不超过两周。保存：固体(密封)及溶解后的底物均应保存在冻箱的冷冻室内。溶解后如长时间不用，应贮存在冻箱的冷冻室内，用时解冻。3.显色剂(二硫代二硝基苯甲酸)配制：分别取160mg显色剂和15.6mg碳酸氢钠,用20mL缓冲液溶解。•保存：固体及溶解后的显色剂均应在冻箱的冷藏室内（3-5℃）保存。•思考题:为什么用缓冲液配置显色剂?4.提取剂(PH8.0缓冲液)•配制：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾,用1000毫升蒸馏水溶解。•保存：固体及溶解后的提取试剂均可在常温下保存。•思考题:为什么用缓冲液作提取剂?四取样要求•叶菜：用取样器随机取不同植株的叶片。•果菜及水果类：用取样器沿果菜表面处取约1厘米厚的样本。五检测步骤1,选取有代表性样品,冲洗掉表面的泥土,剪成1cm左右见方的碎片,取1g样本，放入提取瓶中,加入5mL缓冲液,振荡1～2min,倒出提取液,静置3～5min,待用.2,对照溶液测试:先于试管中加入2.5mL缓冲液,再加人0.1mL酶液,0.1mL显色剂,摇匀后于37℃放置15分钟以上(每批样品的控制时间应一致).加入0.1mL底物摇匀,此时检测液开始发生显色反应,应立即放人仪器比色皿中,记录3min内吸光度的变化ΔA0.3,样品溶液的测试:先于试管中加入2.5mL样品提取液,其他操作同对照相同,记录反应3min的吸光度变化值ΔAt.六检测结果计算公式△Ao-△At抑制率（％）＝――――――×100%△Ao△Ao:对照底物反应3分钟后与3分钟前吸光值之差△At：样本底物反应3分钟后与3分钟前吸光值之差七结果判定1.检测结果判断•检测结果以酶被抑制的程度（抑制率，％）表示：•当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中存在高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。•对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。2检测结果说明检测结果中有时