微生物——浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法教案

1浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法摘要..............................................................................................21.熏马肉介绍...............................................................................22.熏马肉制品的感官指标..........................................................23.熏马肉制品的理化指标..........................................................34.熏马肉微生物指标..................................................................35.熏马肉中沙门氏菌的检测......................................................45.1沙门氏菌性质..................................................................45.2沙门氏菌的检测方法......................................................45.2.1传统标准检测方法......................................................45.2.2普通PCR检测方法...................................................106.总结.........................................................................................13致谢............................................................................................14参考文献....................................................................................142浅析熏马肉制品中沙门氏菌的检测方法摘要：20世纪50年代以来,国内外学者进行了大量的研究,从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。这些方法包括酶联免疫吸附试验法、免疫磁珠法、免疫荧光标记法、噬菌体裂解试验法、核酸探针法等[3]。现对其传统标准检测方法和普通PCR检测方法作以介绍，并分析比较。关键字：熏马肉制品沙门氏菌PCR检测一、熏马肉介绍熏马肉是新疆地方特产，是哈萨克族风味食品，以马为原料，通过腌制、熏烤、蒸煮等工艺加工而成的熟制品。其肉制品具有特殊的烟熏味呈棕褐色、肉色鲜艳、味道适中、耐藏性好。熏马肉含有十八种氨基酸，高钙富铁、蛋白质含量高；而且脂肪含量低，维生素E含量高，胆固醇含量低。资料显示它的蛋白质含量为20.1%，脂肪含量为2.5%，并含有人体所需的多种维生素。如：VA、VB1、VB2、VC等。马肉含有的十几种氨基酸及人体必需的多种维生素。还含有钙、锌、铁、硒等矿物质，含量丰富，可促进血液循环，预防动脉硬化，增强人体免疫力。马肉脂肪的质量优于牛、羊、猪的脂肪。马肉脂肪近似于植物油，不饱和脂肪酸含量高。不饱和脂肪酸可溶解掉胆固醇，使其不能在血管壁上沉积，对预防动脉硬化有特殊作用。二、熏马肉制品的感官指标熏马制品的感观指标主要从其色泽、分味、外观、组织结构等方面来进行评定，评定表如下：3感官指标项目评价色泽在自然光线下，产品表面呈褐红色、切面为粉红色风味具有熏马肠特有的香味，咸淡适中，鲜嫩可口，入口香味浓厚，回味无穷，无异味外观衣表面干燥完整，并与内容物密切结合，肠头无流油滴，无烧黑、粘液及霉斑；组织结构紧密而坚实，有弹性，切面坚实而湿润，切片性好，无碎屑三、熏马肉制品的理化指标熏马肉的的理化指标很重要，其中包括了重金属砷、铅的指标控制，还有在熏烤过程中产生的苯丙芘的控制，以及向其中加入的抗氧化剂亚硝酸盐的检测。最后的净重按照其包装容量的不同各有所异。以下是熏马制品的理化指标标准：理化指标项目指标亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)≤30mg／kg铅(以Pb计)≤1.0mg／kg砷(以As计)≤0.5mg／kg；苯并芘(a)≤5mg／kg净含量(用感量1／10的天平称重)(200±5)g、(300±8)g四、熏马肉微生物指标熏马制品的微生物指标有细菌总数、大肠菌群及致病菌，其中致病菌不得检出。以下为微生物检测标准：4微生物指标项目指标细菌总数2000个／g大肠菌群30个／100g致病菌不得检出五、熏马肉中沙门氏菌的检测5.1沙门氏菌性质沙门氏菌是肠杆菌科中一种重要的人畜共患病原菌，革兰氏阴性，是细菌性食物中毒的重要致病菌。血清型种类繁多，目前全世界已分离出2523个血清型，我国已发现216个[1].。与人类疾病有关的血清型主要集中于A~E群，包括伤寒沙门氏菌、（甲、乙、丙型）副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。它不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒等动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒[2]。5.2沙门氏菌的检测方法肉制品中沙门氏菌的检测有很多方法，这些方法包括酶联免疫吸附试验法、免疫磁珠法、免疫荧光标记法、噬菌体裂解试验法、核酸探针法等[3]。现对其传统标准检测方法和普通PCR检测方法作详细介绍。5.2.1传统标准检测方法传统标准检测方法，包括前增菌,选择性增菌,选择性平板分离,生化试验,血清学分型鉴定五个步骤。5.2.1.1设备和材料5.2.2.1.1恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃5.2.2.1.2拍击式均质器5.2.2.1.3电子天平：感量0.1g5.2.2.1.4无菌锥型瓶：容量500ml,250ml5.2.2.1.5微量移液器及吸管5.2.2.1.6无菌培养皿：直径90mm55.2.2.1.7无菌试管：3mm×5mm、10mm×75mm5.2.2.1.8无菌毛细管5.2.2.1..9三角烧瓶5.2.1.2培养基和试剂5.2.1.2.1缓冲蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g，NaCl5g，Na2HPO4`12H2O9g，KH2PO41.5g,加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三瓶，121℃，灭菌20min。5.2.1.2.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：称取18.72g,加蒸馏水200ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，121℃，灭菌20min，此上配制的为基础液，冷却至50℃，每100ml基础液加入碘液2ml，0.1%煌绿液1ml，混匀备用。5.2.1.2.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：称取4.6g，加蒸馏水200ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，无需高压灭菌，冷却至常温立即使用。5.2.1.2.4亚硫酸铋（BS）琼脂：称取39.3g，加蒸馏水950ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，为基础液；称取8g指示剂，加水50ml，水浴50℃左右，搅拌溶解，将50ml指示剂加入950ml已冷却到50℃的基础液，混匀后立即倾注平板。5.2.1.2.5HE（HektoenEnteric）琼脂：称取牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，冷却到50℃，立即倾注平板。5.2.1.2.6三糖铁（TSI）琼脂：5.2.1.2.7蛋白胨水、靛基质试剂：5.2.1.2.8尿素琼脂（PH7.2）：5.2.1.2.9氰化钾（KCN）培养基及其对照氰化钾培养基：5.2.1.2.10赖氨酸脱羧酶试验培养基及其对照培养基：5.2.1.2.11甘露醇及山梨醇培养基：5.2.1.2.11邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：65.2.1.3检验程序[4]5.2.1.3.1沙门氏菌检验程序见图1.5.2.1.3.2.操作步骤5.2.1.3.2.1培养基的配制,按照1.2的部分配制。5.2.1.3.2.2前增菌称取25g样品放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min。样品为液态，直接进行培养，于36℃±1℃培养8h~18h。75.2.1.3.2.3选择性增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10mlTTB培养基内；于42℃±1℃,18h~24h培养。另取1ml,转种于10mlSC内，于36℃±1℃,18h~24h培养。5.2.1.3.2.4选择性平板分离分别用接种环取经TTB增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。同时，另取SC增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。于36℃±1℃分别培养18h~24h（HE琼脂平板）或40h~48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1表1沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金色光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色5.2.1.3.2.5生化试验5.2.1.3.2.5.1扩培典型或可以菌落自选择性琼脂平板上挑取一个典型或可以菌落，营养琼脂平板，与36℃±1℃培养18h~24h，必要时可延长至48h。得到纯培养。5.2.1.3.2.5.2接种生化培养基将营养琼脂平板上的纯培养物接种三糖铁琼脂，现在先在斜面划线，在于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基。赖氨酸脱羧酶实验要同时接种试验管和对照管。同时，可直接接种蛋白胨水（供作靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基、甘露醇和山梨醇试验。所有试管于36℃±1℃培养18h~24h氰化钾必要时可延长至48h，将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。5.2.1.4.结果观察与判断85.2.1.4.1通过TSI和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断，反应结果见表2表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果：三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢-++(-)+(-)+可疑沙门氏菌属-++(-)+(-)-可疑沙门氏菌属+++(-)+(-)+可疑沙门氏菌属+++/-+/--非沙门氏菌注：+阳性，-阴性；+(-)多数阳性，少数阴性；+/-阳性或阴性表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也有不是沙门氏菌属的可能。注：TSI结果判定方法：斜面黄色为+，红色为-；底层黄色为+，红色为-；产气可以观察培养基内的气孔；硫化氢的判断是培养基转黑色为+，黄色为-，入试管地步全部为黑色可以判断底层为+。赖氨酸脱羧酶试验试管为蓝绿色，对照变黄为阳性，试验管和对照管均变黄为阴性。5.2.1.4.2通过TSI反应中的H2S、靛基质试验、尿素琼脂(pH7.2)、KCN实验结果，查表3将可疑反应分为A1、A2、A3。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢(H2S)靛基质pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注：+阳性；-阴性；+/-阳性或阴性9注：靛基质试验在培养后加靛基质试剂2~3滴，立即观察，表面为红色为阳性，不变色为阴性；尿素实验结果为桃红色是阳性，淡橙红色是阴性；氰化钾浑浊，有菌生长为阳性，反