专题报导性肿瘤之线体常与应用癌细胞线体为标靶之化学治策的发展

CHEMISTRY（THECHINESECHEM.SOC.,TAIPEI）December.2006Vol.64,No.4,pp.435~450專題報導惡性腫瘤之粒線體異常與應用癌細胞粒線體為標靶之化學治療策略的發展洪文怡1李新城1*魏耀揮2*1國立陽明大學藥理學科暨藥理學研究所2國立陽明大學生化暨分子生物研究所摘要：臨床上常用的化學療法經常面臨無法選擇性傷害腫瘤細胞以及克服抗藥性的阻礙而影響其治療效果，因此以腫瘤細胞與正常細胞代謝之顯著差異作為藥物作用標的是改善傳統治癌策略的必要對策。粒線體於細胞中扮演相當重要的生理調控角色，不但負責檸檬酸循環與脂肪酸代謝反應，進行呼吸與氧化磷酸化作用以合成ATP，同時也參與細胞凋亡之調控與執行。除了身兼供給能量及決定細胞生死的角色，粒線體於腫瘤細胞的生長發展過程中也有重要的影響。早在1930年代，OttoWarburg即發現粒線體功能缺陷可能與癌症的發生有關，並可能是造成腫瘤細胞糖解作用增加的原因。最近十幾年來，由人類各種腫瘤組織的研究，科學家已經發現其粒線體DNA具有較高的突變率以及部份腫瘤含有較低的粒線體DNA拷貝數。由於粒線體DNA的完整性影響著粒線體呼吸酵素的表現及功能，因此其變異可能造成腫瘤細胞中粒線體呼吸酵素之功能異常。另外，腫瘤細胞中由細胞核DNA所表現的粒線體呼吸及代謝相關酵素如succinatedehydrogenase（SDH）及主要負責調控粒線體膜通透性的Bcl-2superfamily與由多個粒線體蛋白組成的粒線體膜通透孔洞（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP）也被發現有異常的狀況。這些變異將導致腫瘤細胞無法在一般生理情況下進行細胞凋亡以及對部分化療藥物產生抗藥性。利用腫瘤細胞與正常細胞中粒線體在質與量上的顯著差異，以粒線體作為抗癌藥物作用的標的將具有發展潛力。近年來陸續有許多具抗癌效用之粒線體標定化合物被發表，部分甚至已進入臨床試驗階段。因此，本文將簡述腫瘤細胞中粒線體及粒線體DNA的變異情形，以及針對各具潛力之粒線體作用點，分類說明目前已開發或正在開發中之粒線體標定化合物的抗癌機制及臨床應用。關鍵字：抗癌藥物、細胞凋亡、化學治療、粒線體、粒線體DNA、粒線體標定藥物一、前言目前絕大多數惡性腫瘤的治療仍未有專一有效的藥物或療程設計出現。現行的化學治療藥物多以阻礙癌細胞的增生為抑制腫瘤生長的主要策略，但此一治療方式常因為同時傷害了部份也具有快速分裂特性的正常細胞，影響造血及免疫等正常生理功能而導致嚴重的副作用。此外，細胞癌化或腫瘤細胞進一步惡化的過程中，也會因為許多異常的基因表現和細胞結構變異而出現抗436中華民國九十五年第六十四卷第四期藥性，降低了化學治療藥物的療效(1)。現行化學療法在臨床上的治療效果往往不如預期，在被治癒的癌症案例中，經由化學療法所治癒者僅佔百分之十至十五(2)。因此，研發具有腫瘤細胞專一性的抗癌藥物可說是改善化療治癒率的重要課題。針對腫瘤細胞特異的生化性質尋找影響腫瘤細胞生長的關鍵標的，設計藥物及治療策略以專一性殺死腫瘤細胞或抑制其增生，才能達到控制腫瘤生長及預防其復發的效果。能量代謝方式的不同是腫瘤細胞與正常細胞之間最顯著的差異之一。正常細胞在有氧環境下主要經由粒線體呼吸作用消耗氧氣生成ATP作為能量，其中僅少部分(5-6%)的ATP是來自於糖解作用（glycolysis）；但是對於腫瘤細胞而言，儘管是處在有氧狀態下，糖解作用卻是其主要的能量來源。腫瘤細胞這種轉換提升糖解作用的特性被稱作Warburgeffect，此乃依據最早發現此一腫瘤細胞特性的德國生物化學家OttoWarburg所命名。Warburg曾針對腫瘤細胞糖解作用效率增強的現象提出解釋，他認為腫瘤的發生與細胞粒線體呼吸功能的缺陷有關，而如此的缺陷可能是導致細胞必須代償性增強糖解作用以維持腫瘤細胞生長所需能量的重要原因(3,4)。雖然Warburg的假設在爾後的研究中被證明並非完全正確，因為腫瘤細胞中的糖解作用現象之肇因相當複雜，不僅是粒線體的功能缺陷，已經有許多研究發現腫瘤細胞所遭遇的低氧壓環境以及致癌基因的調控也是重要的因素。然而Warburg的觀察與假設卻清楚地指出了同時參與細胞呼吸作用及醣類代謝的粒線體於腫瘤生成過程中的重要性(4)。近幾年來許多與腫瘤相關的研究中，粒線體的異常變化是觀察腫瘤細胞與正常細胞差異的一項重點，例如腫瘤細胞中粒線體電子傳遞鏈組成蛋白及糖解作用酵素的基因表現上的變異和功能上的缺失，以及粒線體DNA的突變等，都可能是造成腫瘤細胞中粒線體的呼吸產能效率和有氧代謝功能下降的原因(5,6)。另一方面，腫瘤細胞中普遍呈現異常的細胞凋亡（apoptosis）也與粒線體功能缺陷有關。粒線體的膜電位以及膜的完整性可說是防止細胞凋亡的屏障，一旦粒線體膜通透性增加及膜電位下降，粒線體內的細胞色素c(cytochromec)和凋亡誘導因子(apoptosis-inducingfactor，AIF）等促進細胞凋亡的蛋白質或因子釋出，便會活化下游的caspase訊息傳導路徑而最終導致細胞凋亡。然而，在腫瘤細胞中，細胞凋亡路徑常被發現有異常的現象，例如在各種癌症中普遍存在的Bcl-2superfamilyproteins表現變異，包括抑細胞凋亡因子Bcl-2高度表現(7)以及促進細胞凋亡因子Bcl-2-associatedXproteins（Bax）的表現減弱(8)等，都會直接或間接地減少細胞在死亡訊息刺激下粒線體膜通透性增加的機會，阻礙下游訊息傳遞而導致臨床常用以促進細胞凋亡的doxorubicin和cisplatin等抗癌藥物之療效降低。此外，粒線體進行氧化代謝過程中所產生的活性氧分子（reactiveoxygenspecies，ROS）是促進癌細胞惡化轉型的重要因子，ROS在正常細胞中的含量會受到抗氧化酵素如superoxidedismutase（SOD）及glutathioneperoxidase等的氧化還原調節而呈現動態平衡的狀態。然而，在腫瘤細胞中抗氧化酵素的表現及功能的變化所產生的失衡以及粒線體呼吸功能的缺陷，使得腫瘤細胞長期處在高氧化性壓力的狀態，且經ROS促進細胞生長因子表現以及增加DNA突變的作用而使細胞加速癌化，因此大大地增加了對於利用促進自由基生成為主要作用機制的抗癌藥物產生抗藥性之可能性(9)。由前述所列的腫瘤細胞與正常細胞代謝之顯著差異中，不難發現粒線體位於重要的關鍵位置，顯示粒線體是極具潛力的抗癌藥物作用標的。近幾年來陸續有許多具抗癌效用之粒線體標定化合物被開發出來，其中有一些甚至已進入臨床試驗階段。本文綜合最近有關腫瘤細胞粒線體之研究結果，並針對各種可能具有開發為抗癌藥物潛力之粒線體作用部位，分別闡述目前已發表之粒線體標定化合物之抗癌機制及其臨床應用。二、腫瘤細胞中粒線體的變異到目前為止，雖然有許多的研究與觀察試圖解釋Warburgeffect背後的分子機轉與其重要性，但是仍缺乏具體而完整的證據。過去十餘年來的研究已經找到許多可能造成癌細胞具有較高糖解作用活性的可能原因。這些原因包括：（1）在腫瘤生成（tumorigenesis）的過程中腫瘤細胞處在缺氧的環境中生長，而低氧壓所引發的hypoxiainducingfactor-1α(HIF-1α)提高了糖解作用所需酵素的基因與蛋白的表現(10,11)。（2）致癌基因c-myc的大量表現(12,13)，以及常在癌細胞中高度活化的Akt(14)，都分別被證實可以提高糖解作用所需酵素的基因與蛋白的表現。然而，這些證據雖然可以部分解釋癌細胞具有較高的糖解作用活性，但是卻無法提出對於癌細胞之粒線體呼吸功能下降的原因及相關性。2.1粒線體DNA變異在粒線體中總長為16,569鹼基對的粒線體DNA呈中華民國九十五年第六十四卷第四期437現環狀雙股結構，帶有合成粒線體呼吸鏈部分組成蛋白所需的13個基因以及進行蛋白質合成所必須的RNA系統（2個rRNA和22個tRNA）(15)。粒線體DNA進行複製時，於基因序列第16,023至576鹼基對部份之雙股會鬆開，並以特定序列片段與DNA複製相關因子如mitochondrialtranscriptionfactorA（mtTFA）、mitochondrialDNAsinglestrandbindingprotein（mtSSB）及DNApolymeraseγ等互相辨識結合而進行複製，形成暫時性的三股結構，而此具有複製及轉錄起始點的粒線體DNA片段即為displacementloop（D-loop），是粒線體DNA上一段不具基因表現的序列(16)。與細胞核DNA不同，粒線體DNA的複製、轉錄以及修復僅依賴位在粒線體內的DNApolymeraseγ，加上粒線體DNA所在位置（位在粒線體間質接近內膜處）與ROS有較高的接觸機會，以及缺乏histones的保護，粒線體DNA受到氧化性傷害產生突變並累積的機率是細胞核DNA的十倍以上(17,18)。於1998年，Polyak等人在人類大腸直腸癌中發現了癌細胞粒線體DNA具有突變的證據(19)。隨後在許多原發性的腫瘤組織中，包括大腸癌(19,20)，膀胱癌(21)，頭頸部癌症(21)，肺癌(20,21)，肝癌(20,22,23)，胃癌(24,25)，卵巢癌(26)，乳癌(27,28)，皮膚癌(29)及口腔癌(30)等，都被偵測到許多粒線體DNA突變，其中包括了點突變（pointmutation），斷損突變（deletion），插入性突變(insertion)與粒線體DNA拷貝數的變化等(20,22,23,25,28)。發生在粒線體DNA的基因突變包括在前列腺癌中發現的cytochromecoxidasesubunitI（COI）基因之點突變(31)，乳癌中16SrRNA、NADHdehydrogenasesubunit2（ND2）及ATPase6基因之點突變(32)以及大腸直腸癌中所見之12SrRNA、16SrRNA、ND1、ND5、ND4L、COII、COIII及cytochromeb之點突變(19)等很可能直接影響粒線體呼吸酵素之表現而改變粒線體功能；以Horton等人之研究為例，於50%的臨床腎癌組織中所帶有的ND1基因突變（264bpdeletion）確實會導致ND1之mRNA表現截斷異常（truncated）(23)，且於Petros等人之研究中，前列腺腫瘤細胞中之COI點突變也會導致類似的結果（missenseRNA）(31)。由於粒線體DNA所含有的基因皆參與粒線體之呼吸功能，發生於粒線體DNA之基因突變，極可能經由造成粒線體呼吸酵素表現的異常而阻礙其正常功能並增加ROS的生成，進而促進細胞增生及腫瘤惡化。而這些於癌細胞中發現粒線體DNA突變的證據提供了造成癌細胞之粒線體呼吸功能下降的可能原因，這也是支持Warburg推論腫瘤粒線體呼吸功能缺陷的重要證據。然而，根據臨床腫瘤組織的分析結果，在人類腫瘤細胞中所佔比例最高的粒線體DNA突變並非發生於基因表現部位，而是發生在不含基因的D-loop區域(21,34,35)；此現象發生的可能原因為粒線體DNA進行複製時會在D-loop形成較不穩定的三股結構，加上粒線體DNA所在位置接近粒線體內膜，造成此處容易遭遇電子傳遞鏈所生成ROS的攻擊而產生氧化性傷害(36,37)。最近已有研究顯示，此一D-loop區域是粒線體DNA中最易遭受氧化性傷害且最難被修復的區域(38)。因此，這些證據說明了癌細胞粒線體DNA常發生D-loop區域的突變可能與腫瘤生成過程中所遭受的氧化性攻擊或致突變傷害有關。由於D-loop區域帶有粒線體DNA轉錄及複製之起始點以及相關因子的辨識及結合序列片段，可說是粒線體DNA生合成之調控區域。雖然目前尚無確切證據說明D-loop的突變是否會造成粒線體DNA生合成或呼吸功能的異常，但已有包括本實驗室的許多針對各種人類腫瘤組織的研究顯示，癌細胞之粒線體DNAD-loop區域的突變常發生於分化程度