64岛津液相色谱仪教材

岛津液相色谱仪基础知识岛津液相色谱仪基础知识岛津企业管理（中国）有限公司分析中心岛津企业管理（中国）有限公司分析仪器事业部分析中心分析器事部分析中岛津HPLC的历史岛津HPLC的历史Startedin19691969GPC系统开发1972LC-1（LC-830）销售＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞1978LC-3A系列销售＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞1981LC-4A系列销售＜内置微型计算机的全自动HPLC＞1982LC-5A系列销售＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞1984LC-6A系列销售＜世界上最早的积木型HPLC现在的HPLC的前身＞1984LC-6A系列销售＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞1991LC-10A系列销售＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞1997LC-VP系列销售＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞销售追求性能和操作性更加完善的体型2000LC-2010销售＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞2004LC-20AProminence销售＜为分析实验室带来革新的HPLC＞2010LC-15C销售＜为了让LC分析更为便捷2010LC-30ANexera销售＜130MPa耐压系统，低系统容量，高温分析和样品自动前处理＞在售产品在售产品岛津HPLC的历史岛津HPLC的历史2000THECNLOGYBREAKTHROUGH1997BREAKTHROUGHLC-2010THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexibleHPLCSystemwithMicro-strokeVolumeSolventDeliveryUnitLC-VP2010200820102004THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20AProminenceTHECNLOGYBREAKTHROUGHLC-15CEssentia2008THECNLOGYBREAKTHROUGHUFLCProminenceTHECNLOGYBREAKTHROUGHUHPLCLC-30ANexeraProminenceLC20AProminenceLC-20AProminence基础知识讲解内容基础知识讲解内容1色谱基础知识1、色谱基础知识2硬件基础知识2、硬件基础知识3、定量基础知识4、维护基础知识第一部分第部分色谱基础知识色谱基础知识色谱起源色谱起源石油醚⾊谱⾊素混合物分离组分碳酸钙颗粒色谱发展史色谱发展史20世纪初俄国植物学家MSTswett提出经典液相色谱法；20世纪初，俄国植物学家M.S.Tswett提出经典液相色谱法；20-30年代，柱分配色谱和纸色谱；年代气相色谱薄色谱50年代，气相色谱，薄层色谱；60年代，凝胶渗透色谱及高效液相色谱；70年代，高效毛细管气相色谱法；80年代电色谱；80年代，电色谱；90年代，光色谱。色谱定义色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术色谱定义色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相色谱柱固定相：静止不动的相，色谱柱色谱是种分离技术500mVn色谱是一种分离技术色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量300400enParabenPropylParabearaben分离和定量0100200MethylParabeEthylPButylPa0.00.51.01.52.02.53.0min0色谱分类色谱分类高效液相色谱高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)气相色谱气相色谱GasChromatography(GC)薄层色谱Thin-LayerChromatography(TLC)ThinLayerChromatography(TLC)毛细管电泳CillElthi(CE)CapillaryElectrophoresis(CE)HPLCGC液相色谱：HPLCvsGC以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点大分子强极性适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用性分离的双重作用气相色谱气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力流动相只起运载样品分子的能力HPLC简易流程图HPLC简易流程图输液泵进样器柱温箱检测器⾊谱柱检测器数据处理系统储液瓶HPLC特点HPLC特点分离性能好分离性能好灵敏度高（10-9～10-12g）灵敏度高（1010g）选择性高（同分异构，旋光异构）分析速度快进样量小（1100L）进样量小（1-100L）HPLC分类HPLC分类反相色谱（reversedphasechromatography）反相色谱（reversedphasechromatography）离子对色谱（ion-pairchromatography）正相色谱（normalphasechromatography）离交换色谱离子交换色谱（ionexchangechromatography）尺寸排阻色谱（GPC/GFC）尺寸排阻色谱（GPC/GFC）反相色谱反相色谱——流动相的极性大于固定相的极性C18(ODS)(l)C8(octyl)C4(butyl)非极性苯基TMS-O-Si(CH3)2-C18H37TMS氰基OSi(CH3)2C18H37SiOSiO2相互作用力是什么相互作用力是什么OH疏水性疏水性C18(ODS)弱SiOOH强SiO2OH疏水性疏水性如果样品有如果样品有–CH3CH2CH2碳链作用力强–芳香基作用力强如果样品有–COOH羧基COOH羧基–NH2氨基–OH羟基作用力弱羟基反相色谱流动相的选择反相色谱流动相的选择优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要甲醇、乙腈和THF是常用的有机溶剂。在有缓冲液的情况下，缓冲液的浓度和pH值非常重要。非常重要流动相极性变化对分离的影响流动相极性变化对分离的影响20%水30%水40%水1:对羟基苯甲酸甲酯1:对羟基苯甲酸甲酯2:对羟基苯甲酸乙酯3:对羟基苯甲酸丙酯4:对羟基苯甲酸丁酯有机相:甲醇4:对羟基苯甲酸丁酯固定相极性变化对分离的影响固定相极性变化对分离的影响C8般SiO2C18(ODS)样品一般强SiO2C样品C4弱SiO2样品弱固定相极性变化对分离的影响分析条件ODSCODSCTMSTMS固定相极性变化对分离的影响分析条件柱:Shim-packCLC-ODS流动相:MeOH:H2O=7:3流速ODSCODSC88TMSTMS流速:1.0mL/min温度:40℃进样体积:10L检测器:UV-254nm色谱峰1苯甲酸甲酯1.苯甲酸甲酯2.苯甲酸乙酯3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯反相离子对色谱反相离子对色谱原理样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水性离子对，而为反相色谱固定相保留。固定相疏水性的苯烯烯基苯树脂或键合的硅胶固定相疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂或键合的硅胶流动相水（缓冲液）+离子对试剂+有机溶剂流动相水（缓冲液）+离子对试剂+有机溶剂离子对试剂所带电荷与待测离子相反离子对试剂所带电荷与待测离相反常用离子对试剂阴离子化合物常用离子对试剂–氢氧化四丁基铵–溴化四丁基铵阳离子化合物丁烷基磺酸钠（C4）–丁烷基磺酸钠（C4）–戊烷基磺酸钠（C5）–己烷基磺酸钠（C6）烷磺酸–庚烷基磺酸钠（C7）–辛烷基磺酸钠（C8）癸烷基磺酸钠（）–癸烷基磺酸钠（C10）–十二烷基磺酸钠（SDS）反相离子对色谱流动相的选择反相离子对色谱流动相的选择离子对试剂的类型离子对试剂的类型所带电荷与待测物质相反离子对试剂的浓度10-4~10-2mol/L在一定范围内，浓度越大，被分离物的保留值越大。流动相的pH反相离子对色谱应用反相离子对色谱应用有机酸、碱、盐的分离阳离表活性剂包括—阴阳离子表面活性剂—大分子脂肪酸—烷基磺酸盐和芳香硫酸盐—含氮化合物含氮—生物碱—水溶性维生素水溶性维生素—酚类正相色谱正相色谱——流动相的极性小于固定相的极性硅胶柱:常用氰基柱:常用氰基柱:常用氨基柱:分析糖二醇基柱:分析蛋白质二醇基柱:分析蛋白质SiCHCHCHCNSiO2-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)硅胶SiO2SiCH2CH2CH2OCH(OH)CH2(OH)化学键合相化学键合相相互作用力是什么相互作用力是什么HOSiOH强氢键力SiOHSiOHOH弱OH非常弱氢键力氢键力如果样品有–COOH羧基–NH2氨基OH羟基–OH羟基氢键力强如果样品没有任何官能团，如碳水化合物如果样品有大的基团,由于空间位阻氢键力弱氢键力弱正相模式下流动相的选择正相模式下流动相的选择主要试剂主要试剂烷烃（戊烷、己烷、庚烷、辛烷）芳香烃（苯、甲苯、二甲苯）氯甲烷二氯甲烷氯仿四氯化碳四氯化碳辅助试剂辅助试剂甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氢呋喃(THF)，二氧杂环乙烷，嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，甲醇甲醇为了调整保留时间可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。流动相极性变化对分离的影响流动相极性变化对分离的影响0%甲醇2%甲醇5%甲醇甲醇甲醇甲醇1:邻苯二甲酸二辛酯2:邻苯二甲酸二丁酯3:邻苯二甲酸二乙酯主要试剂:己烷4:邻苯二甲酸二甲酯反相色谱与正相色谱的对比反相色谱与正相色谱的对比反相色谱流动相极性大于固定相极性流适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物分离正相色谱流动相极性小于固定相极性流动相极性小于固定相极性适用于不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物的分离和制备HPLC反相色谱与正相色谱的对比反相色谱与正相色谱的对比反相–保留时间重现性好–固定相耐用正相–对立体异构体有很好的分离（VitaminE等）–保留时间重现性稍差离子交换色谱离子交换色谱原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离固定相离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：水缓冲溶液（常用）或有机溶剂与水缓冲溶液的混合液离子交换色谱所用的缓冲液离子交换色谱所用的缓冲液：阴离子分离：氢氧化物、硼酸盐、碳酸盐、酚盐和两性离子等阳离子分离：矿物酸，如硝酸、盐酸、硫酸和甲基磺酸等离子交换色谱作用力离子交换色谱作用力R离子吸引力N+RR样品R++++++SO3-样品++++++++离子交换色谱应用离子交换色谱应用生物领域（蛋白质、农药、氨基酸分析）离子分离子分阳离子交换剂强阳离子交换剂（SCX）（R-SO3-）弱阳离子交换剂（WCX）（R-COO-）阴离子交换剂强阴离子交换剂（SAX）（R4N+）强阴离子交换剂4弱阴离子交换剂（WAX）（DEAE）尺寸排阻色谱法(SEC)尺寸排阻色谱法(SEC)原理：利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。固定相：一种表面惰性、具有一定孔径的多孔凝胶应用聚合物及生命科学领域应用：聚合物及生命科学领域SEC分类SEC分类凝胶渗透色谱（GPC）凝胶渗透色谱（GPC）主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相（氯仿，THF，DMF）以有机溶剂为流动相（氯仿，，）常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物凝胶过滤色谱（GFC）主要用于生命科学领域主要用于生命科学领域以水溶液为流动相常用固定相填料：亲水性有机凝胶（葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等）GPC分离原理GPC分离原理GPC分离原理GPC分离原理固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部样品与固定相之间无作用力保留