GB4789132012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验中华人民共和国卫生部发布2012-05-17发布2012-07-17实施GB4789.13—2012I前言本标准代替GB/T4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。本标准与GB/T4789.13—2003相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了样品制备过程；——修改了培养基与试剂；——修改了操作步骤；——修改了菌数计算部分；——增加了附录A。GB4789.13—20121食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验1范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；d）天平：感量0.1g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm×180mm；i）无菌培养皿：直径90mm；j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；k）厌氧培养装置。3培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。4检验程序GB4789.13—20122产气荚膜梭菌检验程序见图1。图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2以无菌操作称取25g（mL）样品放入含有225mL0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，作为1:10稀释液。5.1.3以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。检样25g(mL)检样+225mL0.1%蛋白胨水均质、稀释10-1～10-6稀释液各1mL+TSC琼脂混合厌氧培养，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落计数任选黑色菌落5个，分别接种FTG培养基确证试验镜检形态乳糖-明胶动力-硝酸盐牛奶发酵报告GB4789.13—201235.2培养5.2.1吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。5.2.2上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。5.2.3待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养20h～24h。5.2.4典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。5.3确证试验5.3.1从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h。5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36℃±1℃厌氧培养20h～24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h，用于后续的确证试验。5.3.3取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。5.3.4用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。6结果与报告6.1典型菌落计数选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。6.2结果计算6.1计数结果按公式（1）计算：GB4789.13—20124………………………………………………(1)式中：T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；A——单个平板上典型菌落数；B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；C——单个平板上用于确证试验的菌落数；n1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；0.1——稀释系数；d——稀释因子（第一稀释度）。6.3报告根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中公式计算，报告每g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。dnnCBAT)1.0()(21+=∑GB4789.13—20125附录A培养基和试剂A.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂A.1.1基础成分胰胨15.0g大豆胨5.0g酵母粉5.0g焦亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁铵1.0g琼脂15.0g蒸馏水900.0mLpH7.6±0.2A.1.2D-环丝氨酸溶液溶解1gD-环丝氨酸于200mL蒸馏水，膜过滤除菌后，于4℃冷藏保存备用。A.1.3制法将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装到500mL烧瓶中，每瓶250mL，121℃高压灭菌15min，于50℃±1℃保温备用。临用前每250mL基础溶液中加入20mLD-环丝氨酸溶液，混匀，倾注平皿。A.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）A.2.1成分胰蛋白胨15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g蒸馏水1000.0mLpH7.1±0.2A.2.2制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节pH，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.3缓冲动力-硝酸盐培养基A.3.1成分蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g硝酸钾5.0g磷酸氢二钠2.5gGB4789.13—20126半乳糖5.0g甘油5.0mL琼脂3.0g蒸馏水1000.0mLpH7.3±0.2A.3.2制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。如果当天不用，置4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.4乳糖-明胶培养基A.4.1成分蛋白胨15.0g酵母粉10.0g乳糖10.0g酚红0.05g明胶120.0g蒸馏水1000.0mLpH7.5±0.2A.4.2制法加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于1000mL蒸馏水中，调节pH，加入乳糖和酚红。分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌10min。如果当天不用，置4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.5含铁牛乳培养基A.5.1成分新鲜全脂牛奶1000.0mL硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g蒸馏水50.0mLA.5.2制法将硫酸亚铁溶于蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000mL牛奶中，混匀。分装大试管，每管10mL，118℃高压灭菌12min。本培养基必须新鲜配制。A.60.1%蛋白胨水A.6.1成分蛋白胨1.0g蒸馏水1000.0mLpH7.0±0.2A.6.2制法加热溶解，调节pH，121℃高压灭菌15min。A.7革兰氏染色液A.7.1结晶紫染色液A.7.1.1成分结晶紫1.0gGB4789.13—2012795%乙醇20.0mL1%草酸铵水溶液80.0mLA.7.1.2制法将结晶紫完全溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.7.2革兰氏碘液A.7.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.7.2.2制法将碘与碘化钾先混合，加入蒸馏水少许振摇，待完全溶解后，再加入蒸馏水至300mL。A.7.3沙黄复染液A.7.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.7.3.2制法将沙黄溶解于95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.7.4染色方法涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.8硝酸盐还原试剂A.8.1甲液（对氨基苯磺酸溶液）在1000mL5mol/L乙酸中溶解8g对氨基苯磺酸。A.8.2乙液（α-萘酚乙酸溶液）在1000mL5mol/L乙酸中溶解5gα-萘酚。A.9缓冲甘油-氯化钠溶液A.9.1成分甘油100.0mL氯化钠4.2g磷酸氢二钾（无水）12.4g磷酸二氢钾（无水）4.0g蒸馏水900.0mLpH7.2±0.1A.9.2制法将以上成分加热至完全溶解，调节pH，121℃高压灭菌15min。配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油200mL和蒸馏水800mL。