噬菌体展示技术和其应用

2020/5/111Phagedisplay噬菌体展示技术及其应用食品学院廖振林Email：[e-mail]2020/5/112噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。2020/5/113非展示系统展示系统2020/5/114TheexpressionofexogenouspeptidesonthesurfaceoffilamentousbacteriophagewasinitiallydescribedbySmithin1985.Sincehisfirststudy,differentmoleculessuchassmallpeptidesandantibodieshavebeendisplayedoncoatproteinsofphage,greatlyexpandingtheapplicationsofthetechnology.Thepastdecadehasseenconsiderableprogressinthetechniquesandapplicationsofphagelibraries.Inaddition,differentscreeningmethodshaveallowedisolationandcharacterizationofpeptidesbindingtoseveralmoleculesinvitro,inthecontextoflivingcells,inanimalsandinhumans.2020/5/115-Invivouseofphagelibraries.Initiallythephagelibraryisinjectedinthecirculation.Next,phageisallowedtocirculateforminutesorhours(inthiscasewheninternalizedphagesaretoberecovered).Finally,afterdeepanesthesia,miceareeuthanizedandtheorgansaredissectedforphagerecoveryandpeptidesequencing.2020/5/116Phagestructure.PIII,pVI,pVII,pVIIIandpXIXrepresentphageproteins.Exogenouspeptidesareexpressedor“displayed”usuallyonpIIIorpVIII.2020/5/117三丝状噬菌体的生物学形态：长杆状，长度约1um，管直径约6nm。基因组：约6400核苷酸大小的单链线状DNA，结构：●2700个主要蛋白（PVIII）分子螺旋状排列形成长管，●一头5个拷贝的次要壳蛋白PIII和PVI，●另一头则由次要壳蛋白PVII和PIX。生理：●F菌毛结合的序列是PIII蛋白N端的200个氨基酸。●一个分裂周期中可生产几百个子代，●其产量可达到0.3mg/ml。2020/5/118外源蛋白的展示部位2020/5/119噬菌体展示技术所展示外源多肽和及文库1.随机肽库l随机肽库通常较短（4~36氨基酸[8,9]长度）l编码它们的核酸由化学法合成而得l其展示方式包括3，33，3+3，8，88，8+8等2.基因文库l基因组文库如DNAstaphylococcusaurouslcDNA文库l抗体库l病毒cDNA3.各种自然蛋白及蛋白片段等其中包括-半乳糖苷酶等蛋白片段；酶类如碱性磷酸酶，胰酶等；激素类如人生长素，血管紧张激素等；酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂等；毒素如蓖麻毒蛋白B链等；受体如IgE受体亚单位、T细胞受体等；触体如P物质、神经激肽A和B等；抗原及抗原表位；DNA和RNA结合蛋白如锌指蛋白等；酶底物如蛋白酶底物等；细胞素如IL3，IL6等。2020/5/1110抗体库技术简单流程2020/5/1111获得抗体基因2020/5/1112插入载体2020/5/11132020/5/1114表达2020/5/1115筛选2020/5/11162020/5/1117噬菌体展示技术的发展简史1985年Smith—证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造[1]。1988年Parmley—将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢN端融合呈现在其表面[2]。1990年McCafferty—用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代[3]。一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。2020/5/1118噬菌体定义：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。噬菌体宿主菌形态核酸T1-T7、λ、N4大肠埃希菌蝌蚪形dsDNA，线状P1志贺菌蝌蚪形dsDNA，线状P22沙门菌蝌蚪形dsDNA，线状SP01、SP82枯草芽胞杆菌蝌蚪形dsDNA，线状Φ29解淀粉芽胞杆菌蝌蚪形dsDNA，线状PM2假单胞菌微球形，有包膜dsDNA，线状ΦX174、S13、M12、G4大肠埃希菌微球形ssDNA，线状f1、fd、M13大肠埃希菌丝形ssDNA，线状MS2、f2、fr、Qβ大肠埃希菌微球形ssRNA，线状Φ6假单胞菌微球形，有包膜dsRNA，线状，分成3节段噬菌体分类：2020/5/1119丝状噬菌体蝌蚪形噬菌体λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体2020/5/1120T7与M13相比优势明显T7Select的优势解释是在细胞质中表达的裂解性噬菌体与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。C-端融合插入序列被克隆到T7Select载体基因10的C-端，可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。载体克隆容量大T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1kbp的片段都不稳定。插入片段稳定T7重组子很稳定，而M13重组子–尤其是1kb的很不稳定洗提条件灵活M13稳定性尚可，但是洗提条件颇受限制，SDS、盐、离液剂等，都能造成不稳定。而T7在1%SDS，5MNaCl，4M尿素，2M盐酸胍，10mMEDTA,100mMDTT，pH4-10等条件下稳定。生长迅速(小于3小时)，噬斑大明显缩短富集过程，每轮亲和淘洗之间时间少，2天内即可完成标准淘洗包装效率极高(109pfu/ug)操作很简便，只需将DNA加到抽提物中，放置并铺板。克隆效率高M13要用电转化方能获得高效克隆，而T7Select制备大文库则容易得多2020/5/1121噬菌体cDNA展示技术以改构的噬菌体为载体，cDNA基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面，通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体。2020/5/1122噬菌体展示系统的类型产品概况载体用途展示拷贝数/噬菌体展示大小(氨基酸)宿主T7Select415-1多肽41540–50aaBL21T7Select1-1*蛋白或多肽≤11200aaBLT5403或5615T7Select1-2a,b&c蛋白或多肽≤1900aaBLT5403或5615T7Select10-3b*蛋白或多肽约为10564**(上限待定)BLT5403或56152020/5/1123噬菌体cDNA展示技术的应用1用于模拟表位的研究。2用于DNA、RNA结合蛋白的研究。3用于蛋白-蛋白相互作用的研究。4用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。5细胞与蛋白相互作用的研究。6酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。2020/5/11242020/5/1125问题1.没有一个系统能够表达所有的真核细胞蛋白。2.在外源cDNA插入噬菌体载体时存在双向插入，可能导致表达减少或者逆向表达。2020/5/1126展望噬菌体cDNA展示技术有效地实现了基因型和表现型的转换，在分子克隆的基础上，实现蛋白质构想的体外控制，从而可获得具有生物学活性的表达产物。若将其与蛋白质三维结构预测、分子模拟技术完美融合，对分子相互作用、分子识别、受体识别、酶学机制等研究进程将起到极大的推动作用。2020/5/1127应用举例：部分做过的工作2020/5/1128一、半合成噬菌体抗体库的构建构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。2020/5/1129材料和方法人脐带血淋巴细胞Ficoll–paqueplus购自Pharmacia公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司。pComb3噬菌体抗体表达载体：4029bp，含有可插入轻链和重链基因的克隆位点。大肠杆菌XLl-blue辅助病毒VCSM132020/5/1130cDNA制备引物设计电转化感受态的制备辅助噬菌体的制备抗体库制备2020/5/1131结果PCR扩增人抗体基因图3.1λ链PCR扩增结果1-6泳道：VL1,VL2,VL3,VL4,VL5,VL6M：MarkerDL2,000图3.2κ链PCR扩增结果11-3泳道：VK1,VK2,VK3M：MarkerDL2,0002020/5/1132图3.3重链分段PCR扩增结果1－3泳道：H135，H2，H4(约290bp)4－7泳道：CDR3-5,CDR3-8,CDR3-10,CDR3-12(约400bp)M：MarkerDL2,0002020/5/1133图3.4重链重叠PCR扩增结果1－3泳道：CDR3-5+(H135，H2，H4)融合结果4－6泳道：CDR3-8+(H135，H2，H4)融合结果7－9泳道：CDR3-10+(H135，H2，H4)融合结果10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4)融合结果123456M789101112M2020/5/1134图3.5轻链和重链插入pComb3流程HL2020/5/1135人源轻链抗体文库的构建经限制性内切酶SacI和XbaI双酶切的人抗体轻链PCR产物与用相同内切酶酶切、去磷酸化的pComb3载体，16℃连接，用该连接产物进行电转化，根据1μl和10μl菌液铺平板所长出来的菌落数，可推算出人抗体轻链文库的库容量。κ链文库的容量为5.03×106,λ链文库的容量为6.8×106(多次建库混合后的库容量)。从平板上随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养，菌落PCR鉴定。对于λ链文库，10个克隆中有6个阳性，λ链文库的插入率大约为60％；κ链文库10个克隆中有7个是阳性，其插入率大约为70％。2020/5/1136人源噬菌体Fab抗体半合成文库的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产物插入经酶切、并切胶回收纯化的轻链抗体文库中，转化感受态细胞，在辅助噬菌体VCSM13的超感染下，繁殖出表达人抗体Fab段的噬菌体，即为抗体组合文库。1μl和10μl转化菌铺平板计数，计算出κ＋Fd（包括CDR3-5到CDR3-12的全部随机化Fd片段）文库的库容为5.89×106。随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率为60％左右。2020/5/1137以相同的程序构建λ＋Fd链抗体库，库容量为6.55×106,随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中有5个克隆扩增出轻链和重链片段。双链插入率为50％左右。为了提高抗体库的库容量，在增加细菌转化效率的同时，进行了多次转化，每次转化都计算插入率。结果如表所示。2020/5/1138表3.1抗体库的库容与抗体片段插入率ND：未做202