用于抗体药物生产的动物细胞培养基研究进展

中国医药生物技术2014年2月第9卷第1期ChinMedBiotechnol,February2014,Vol.9,No.153DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.01.011·综述·用于抗体药物生产的动物细胞培养基研究进展段须杰，任彤，罗厚勇，刘睿，徐卫涛近年来，具有靶向明确，副作用小等优势的抗体药物受到国内外药企的广泛关注。2012年，抗体药物全球销售额已达650亿美元左右，并占据全球十大畅销药物的半壁江山[1]。动物细胞大规模培养和抗体质量分析已然成为我国抗体药物产业化的主要限制因素[2]。培养基优化作为动物细胞大规模培养的关键环节，长期被国外生物技术公司（如ThermoFisher公司、Sigma公司等）、医药巨头所垄断。尽管目前国内抗体药物的表达水平有显著提高（1~2g/L），但仍以使用商业培养基为主，缺乏自主知识产权的产品。由于对所使用的培养基成分未知，一旦出现抗体质量问题便无从优化，特别对于生物仿制药开发而言，抗体质量的一致性显得尤为重要。与此同时，使用商业化培养基还需承担较高的开发成本，往往是自主开发培养基成本的5~10倍。众所周知，培养基开发工作与生产用细胞株特征关系密切，因此，在培养基开发过程中需要围绕生产用细胞株的特点进行“个性化培养基”的设计和优化。本文从抗体生产用动物细胞入手，重点关注近年来国际上关于动物细胞培养基开发的昀新报告，以介绍CHO细胞和NS0细胞培养基为主，详细阐述培养基各类组分、功能以及开发策略，以期对国内药企进行培养基开发起到指导作用，并对未来培养基研发趋势进行展望。1生产用动物细胞概述对于抗体药物而言，为了满足其生物活性，需要对蛋白质进行正确的折叠和翻译后修饰，因此用于抗体生产用宿主细胞以哺乳动物细胞为主。迄今为止，在已批准的抗体药物中，所使用的动物细胞主要包括CHO细胞、NS0细胞和SP2/0细胞，其中CHO细胞作为生产用宿主细胞达到50%左右，NS0细胞达到20%以上[3]。CHO细胞是1957年Tjio和Puck将原代培养的中国仓鼠卵巢细胞永生化获得的，包括K1、DG44和DUXB11三种。其中，DG44和DUXB11细胞由于不具有二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）活性，需要添加甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷才能正常生长。因此两者通常采用DHFR筛选系统获得生产用细胞株。而CHOK1则恰恰相反，常与谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase，GS）筛选系统联用。NS0细胞是由Galfr和Milstein于1981年获得的一株不合成分泌免疫球蛋白重链或轻链的鼠骨髓瘤细胞。与CHO细胞相比，NS0细胞更倾向于凋亡，可能是由于营养物耗竭或者培养微环境产生的压力所造成[4]。此外，NS0细胞为胆固醇营养缺陷型，因此在培养过程中需要添加胆固醇以维持细胞正常生长。由于NS0细胞内源GS缺乏活性，因而常与GS筛选系统联用获得稳定高产的细胞株。从表达抗体质量的角度来看，CHO细胞生产的抗体与人类自身抗体更为接近，而采用NS0或SP2/0细胞所表达的抗体则会产生非人源的糖基化修饰，如α(1,3)-半乳糖结构和N-羟乙酰基神经氨酸（N-glycolylneuraminicacid，NGNA）唾液酸结构，在人体内会产生免疫原性，因而近年来较为少用[3]。值得一提的是，CHO细胞的内源性反转录病毒不易传播人类，而NS0细胞则可能产生传染性反转录病毒[4]。除此之外，PER.C6细胞作为一种新型的宿主细胞已用于表达抗体药物，并能够获得与人类更为接近的糖基化结构。但到目前为止，采用PER.C6细胞生产的多种候选抗体药物仍处于临床研究阶段。2培养基组分及功能由于动物细胞对营养物质、培养环境的要求较为苛刻，培养基一般包括60~80种营养物质，某些培养基组分甚至超过100种。除此以外，不同种类的动物细胞对于培养基组分的要求也不尽相同，而且组分的改变也会对抗体的质量产生显著影响。因此，如何依据动物细胞种类，通过培养基优化以满足抗体产量和质量的“双重要求”成为抗体产业化过程中亟待解决的关键环节。本文将以介绍CHO细胞和NS0细胞培养基为主，逐一阐述动物细胞培养基成分及其相应作用，为开发适合动物细胞的“个性化培养基”提供理论指导。2.1水水是培养基的重要组分之一，却往往被研究人员所忽视，培养基用水品质的好坏将直接影响到细胞的生长状态。水中的污染物主要包括无机物、有机物、细菌产物（内毒素）、颗粒等。无机物包括重金属、铁、钙、氯等。有机物主要是植物腐败的副产物和洗涤剂。因此培养基用水必须经过高度基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09105301）作者单位：210042南京，江苏先声药业有限公司通讯作者：段须杰，Email：[e-mail]收稿日期：2013-07-2654中国医药生物技术2014年2月第9卷第1期ChinMedBiotechnol,February2014,Vol.9,No.1纯化获得。一般而言，培养基采用注射用水或者采用同级别的超纯水进行配制。2.2碳水化合物葡萄糖是培养基中昀常使用的碳水化合物，用于提供能源。然而，葡萄糖代谢会产生对细胞生长和抗体合成重要影响的副产物——乳酸。通过控制葡萄糖浓度或者采用其他能源物质（如半乳糖、果糖等）可以降低培养过程中的乳酸产量，但可能会对抗体的糖基化类型产生影响，进而影响抗体在体内的生物活性[5-7]。此外，也有文献报道通过在培养基中添加丙酮酸代替谷氨酰胺作为能源物质，可以降低乳酸和氨的产量[8]。2.3氨基酸构成生物体蛋白质的氨基酸约20种，大体可分为必需氨基酸（essentialaminoacid，EAA）和非必需氨基酸（nonessentialaminoacid，NEAA），它们不仅用于合成蛋白质，同时还通过氨基酸代谢途径提供能源。由于不同种类的动物细胞甚至同一类别的不同克隆对于氨基酸的代谢情况都可能完全不同，因此，对于培养基中氨基酸的优化显得尤为重要，不但要保证各种氨基酸浓度的平衡，同时要避免因某种氨基酸消耗殆尽，导致细胞生长停止或者凋亡[9]。谷氨酰胺作为重要的能源物质，同时还是嘌呤、嘧啶的合成前体，对于非GS表达系统的细胞（如CHO-DHFR细胞）生长十分重要，主要是由于细胞内源GS基因表达水平较低所致。而对于GS表达系统的细胞（如GS-CHO和GS-NS0）而言，谷氨酰胺则无需添加至培养基。除此以外，还应根据具体的细胞株特性来有选择地添加氨基酸，例如有些CHO细胞属于脯氨酸缺陷型，因此需将脯氨酸作为EAA添加至培养基中。2.4维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要的生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶。维生素分为水溶性和脂溶性两类。水溶性维生素主要指B族维生素，包括硫胺素（B1）、核黄素（B2）、烟酰胺（B3）、泛酸（钙）（B5）、吡哆醇（醛）（B6）、生物素（B7）、叶酸（B9）和氰钴胺素（B12）。脂溶性维生素主要有维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。与脂溶性维生素相比，水溶性维生素能够更好维持细胞生长并保证较高的活率[10]。此外，维生素C或维生素E通常作为抗氧化剂添加至培养基中，但对细胞生长或者抗体合成影响较小[11]。2.5无机盐及微量元素培养基中的无机盐包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl–、HPO42–、H2PO4–、HCO3–等。其中，Na+、K+和Cl–负责调节许多营养物质和大分子的跨膜运输；Mg2+是细胞间质的重要组分，同时还是酶反应的辅因子；Ca2+参与细胞生理活动，并调节细胞膜功能；HCO3–主要起到pH缓冲作用。deZengotita等[12]研究发现通过流加NaH2PO4可以显著提高GS-NS0细胞密度，可能是由于磷元素是细胞磷脂、DNA和RNA的重要组成部分。微量元素主要包含铁、铜、锌、硒、锰等。铁是一种必需元素，因为铁涉及众多参与DNA复制和细胞代谢的酶，铁缺陷会引起细胞周期停滞在G0或者G1期，甚至使快速分裂的细胞发生凋亡[13]。铜离子作为培养基中重要的氧化剂，对抗体质量（二硫键形成、C末端降解、唾液酸含量等）、细胞代谢（细胞密度、乳酸含量等）都会产生重要影响[14-15]。锌作为胰岛素的替代物，在无蛋白培养基开发中得到广泛应用[16]。硒元素则是谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，能够保护细胞不受活性氧的伤害[17]。锰元素作为一系列糖基转移酶重要辅因子，在抗体糖基化过程中起到关键作用，改变培养基中Mn2+浓度可以显著影响抗体的糖基化特征[18]。2.6脂类及前体脂类是细胞膜的重要组成部分。由于磷脂、脂肪酸和胆固醇共同影响细胞膜的流动性，氯化胆碱、肌醇、乙醇胺、油酸、亚油酸等物质常以脂类前体形式添加至培养基中用于合成细胞膜。与CHO细胞不同，NS0细胞通常为胆固醇缺陷型，因此在NS0细胞培养中常将胆固醇以脂类混合物的形式添加，但是脂类的添加有可能会改变蛋白的糖基化特征[19-20]。此外，Li等[4]通过在培养过程中添加5-氮杂胞苷使得NS0细胞成为胆固醇非依赖性细胞，抗体产量达到4.5g/L。2.7核苷动物细胞一般可以通过从头合成途径合成核苷酸，因此一般情况下不需要在培养基中添加外源核酸类物质。但对于从头合成途径受阻的细胞（DHFR缺陷型细胞）就必须添加补救途径的底物——次黄嘌呤和胸苷。Chen等[21]研究发现每5mg/L胸苷中添加10mg/L次黄嘌呤能够显著促进CHO细胞生长。Carvalhal等[22]在培养基中添加1mmol/L腺嘌呤或鸟嘌呤会造成CHO细胞生长严重抑制，而相同浓度的尿嘧啶或胞嘧啶则对细胞生长没有影响。此外，核苷类物质的添加还可能对抗体的糖基化特征产生影响，因此在培养基优化时需特别注意[23]。2.8生长因子及转运蛋白胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）常添加至培养基中，两者均能够刺激葡萄糖利用，以及RNA、蛋白质和磷脂的合成。Rouiller等[24]通过添加糖皮质激素（氢化可的松）可以显著提高CHO细胞活率并提高蛋白产量，而Jing等[25]通过添加地塞米松在提高糖蛋白的唾液酸含量方面取得了成功。转铁蛋白是一种常用的糖蛋白，能够结合铁，与铁向细胞的传递密切相关。由于转铁蛋白成本较高，人们逐渐采用铁螯合剂来代替转铁蛋白。Zhang等[26]发现柠檬酸铁和亚硒酸钠的复合物能够有效地代替转铁蛋白。陈飞[27]认为在无血清培养基中没有柠檬酸铁存在时，即使添加高浓度的转铁蛋白也不能有效支持CHO细胞生长和抗体表达，也就是说柠檬酸铁在支持CHO细胞生长方面具有转铁蛋白不可替代的作用。中国医药生物技术2014年2月第9卷第1期ChinMedBiotechnol,February2014,Vol.9,No.1552.9其他物质2.9.1还原剂还原型谷胱甘肽和巯基乙醇通常作为还原剂添加至培养基中，可以保护细胞免受活性氧损伤，对维持细胞活率起到一定作用。2.9.2保护剂PluronicF68、甲基纤维素和聚乙烯醇常作为保护剂加入培养基中，可减少细胞与气泡间的黏附力，避免由于气泡破裂对细胞造成的损伤[28]。2.9.3诱导剂丁酸钠作为一种诱导剂，常添加至培养基中用于提高抗体产量[29]，但是丁酸钠的加入可能对抗体的糖基化形式也会有影响。Borys等[30]通过添加丁酸钠显著降低了NGNA的含量。3培养基开发策略及手段3.1培养基开发策略尽管CHO细胞和NS0细胞对于培养基组分的要求有所不同，但是都需要添加数十种组分来维持细胞的正常生长和抗体表达。与此同时，进行培养基优化时不仅需要考虑单一组分的影响，还要关注组分间还可能存在的交互作用，这就使得培养优化成为耗时且复杂的工作。因此，选择合适的培养基开发策略及手段将直接决定培养基的开发时间和昀终效果。对于动物细胞的培养基开发策略大体相同，主要分为基础培养基开发和流加培养基开发两个阶段。3.1.1基础培养基开发策略基础培养基是以支持并促进细胞生长