生物传感器-5

第8章电化学传感器之五:直接电化学酶电极8.1概述酶电极经典酶电极第一代生物传感器介体酶电极第二代生物传感器直接电化学生物传感器第三代生物传感器电极过程由固定化生物膜和基础电极完成电极过程由化学介体分子介导酶分子被直接修饰在电极表面酶与电极直接进行电子传递速度不快的原因:1)大多数蛋白质的电活性中心包埋在蛋白质分子深处,距离电极较远;2)蛋白质吸附在电极表面以后,分子部分变性;3)不合适的空间取向.8.2原理与特点1)不需要氧分子,不需要介体,不需要固定化载体，酶直接吸附固定在电极表面,与电极直接“交流”，电子传递快，电极响应速度更快、灵敏度更高，成为真正“无试剂分析”2)酶与电极直接电子传递，降低了系统非特异性反应倾向8.3进行直接电化学反应的酶和蛋白质8.3.1氧化还原酶类1)需氧脱氢酶类(aerobicdehydrogenase)以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)为辅酶,以氧为直接氢受体,产物为H2O2或超氧阴离子O2-.如黄嘌呤氧化酶、醛脱氢酶、NADH氧化酶等。2)厌氧脱氢酶(anaerobicdehydrogenase)电子受体不是分子氧而是某些辅酶(NAD+、NADP+)或辅基(FAD、FMN)，辅酶或辅基还原后又将氢原子传递至氧化呼吸链，最后将电子传给氧生成水。在此过程中释放出的能量使ADP磷酸化生成ATP。3)加氧酶类(oxygenase)催化加氧反应。加氧反应中，氧分子中的一个原子加到底物分子上使之羟化，另一个氧原子被NADPH2+提供的氢还原成水。4)过氧化氢酶或过氧化物酶类(peroxidase)过氧化氢酶催化两个H2O2分子的氧化还原反应，生成H2O并释放出O2.8.3.2氧化还原酶的电子传递氧化还原酶和蛋白质的氧化还原中心主要含有三种基团：亚铁血红素(heme)、铁至硫族和铜。实现直接电化学反应，要求酶的氧化还原中心不被屏蔽，并提供比较高的工作电位。一般认为，酶与电极进行直接电化学反应的基本条件是酶的催化活性部位与电极靠近(2nm)。目前所研究的大多数酶类不适于用直接电化学反应。氧化还原酶内源性外源性intrinsicextrinsic催化反应发生在酶的氧化还原中心，从中心到分子表面没有电子转移通道需要有另外一个蛋白质(称为辅助蛋白)介入电子转移，电子转移通道处在酶的表面与辅助蛋白的结合部位。-700-600-500-400-300-200-1000100200300400500600葡萄糖氧化酶-635mvNAD+/NADH-560mV黄素酶，PQQ-酶亚铁血红素-酶最佳电位范围过氧化物酶-亚铁血红素E/mV,pH7.0图8-2各类辅酶的氧化还原电位背景电流低，噪声低，没有分子氧还原，抗坏血栓、尿酸、扑热息疼等小分子电极活性物质的氧化将到最低程度。8.3.3亚铁血红素血红蛋白色素部分，由铁原子及原卟啉区组成.图8-3亚铁血红素分子8.3.4细胞色素C细胞色素C(cytochrome,C)是一种古老的蛋白,在生命进化早期就存在.它在细胞能量产生过程中发挥关键的作用,其分子进化比较保守.从酵母到植物,甚至人体细胞,其组成结构都很相似.CytC是一种含亚铁血红素的氧化还原蛋白,存在于细胞线粒体中,在呼吸链的电子传递中起重要的作用.亚铁血红素通过硫醚键与CytC的半胱氨酸结合,并部分地暴露在溶液/电极表面,其氧化还原过程能够给出强的电化学信号和光学测量信号.电化学研究表明,CytC在电极表面的空间取向控制对产生可逆的电化学反应影响很大.使电极表面带负电会使CytC在电极表面的反应更容易.图8-4紫红假单胞菌CytC三维结构8.3.5细胞色素P450细胞色素P450也是一种以血红素为辅基的b族细胞色素,广泛存在于各种生物体内.细胞色素P450中,血红素的Fe3+可被还原为Fe2+,还原型的细胞色素P450与CO结合后在450nm处有最大吸收峰,故称为细胞色素P450.在其结构序列非常多,如图是甲单胞菌的细胞色素P450的三维结构.图8-6假单胞菌细胞色素P450的三维结构细胞色素P450能与氧直接反应,将电子传递给氧,因此是一种终末氧化酶,其反应机理如下:Fe(III)[R-H]+eFe(II)[R-H](R-H为酶蛋白-血红素)Fe(II)[R-H]+O2Fe(III)[R-H]O2-[R-H]+H2OFe(III)[R-H]O2-[R-H]+e+2H+Fe(V)=O[R-H]+H2OFe(V)=O[R-H]Fe(III)R-OH在细胞内,细胞色素P450参与催化多种反应,如毒物和药物代谢,还可以在体外直接氧化多种化合物和农药,如四氯化碳、二甲基苯、溴苯、乐果、对硫磷、马拉硫磷等。其反应归纳起来包括：环氧化作用、N-脱烷基作用、O-脱烷基作用、S-氧化作用和羟化作用等。最典型的催化反应如下：NADPH+H++O2+RHNADP++H2O+R-OH脂肪酸单加氧酶细胞色素P450是一种多域结构:二黄素(FDA/FMN)氧化酶域和血红素域，是一种比较理想的研究电子传递的分子模型．当固定于电极表面时可以获得循环伏安电流峰，这是黄素还原酶域和Fe3+/Fe2+氧化还原对共同起作用的结果.蛋白质在电极表面固定后,还原酶的峰逐渐消失而血红素的峰逐渐增强,但是在溶液中由于蛋白质在修饰电极表面的重新组装和更新电极而使峰能维持长时间不变.蛋白质固定在电极表面蛋白质在溶液中氧化酶域峰逐渐减小而血红素域峰逐渐增加的可能原因:蛋白质在电极表面的构型从利于氧化酶域电子传递转变为有利于血红素域的电子传递;也有可能是氧化酶在电极表面的变质所致.所以当蛋白质在溶液中氧化酶峰下降很慢,溶液中的蛋白质可以更新电极上反应的蛋白质.在裸的和DDAB修饰的表面,氧的峰电位大约在-0.5到-0.7V,heme的存在大大降低了氧的过电位嗜热嗜酸菌的细胞色素P450可能是高温下活性部位的构型变化使高温有利于蛋白质的电子传递8.3.6过氧化物酶过氧化物酶都能以过氧化氢为底物,以亚铁血红素为辅因子.其中,辣根过氧化物酶是使用最广泛的分析用酶之一,可以直接在电极上进行过氧化氢和其他过氧化物的测定,其酶的三维结构如图:图8-7辣根过氧化物酶三维结构酶为六聚体,每个亚基含有一个血红素过氧化物酶的催化过程如下:POD+H2O2CpdI+H2OCpdI+SCpdII+S˙CpdII+S+2H+POD+S˙+H2OPOD是铁酶,CpdI和CpdII分别是POD的氧化中间体I和氧化中间体II;S和S˙分别为电子供体(donor)和其氧化产物.如果酶被固定在电极上,电极能够提供电子给氧化态的酶,则成为非介导的直接电子传递模式(也就是直接电子传递):CpdI+2e+2H+POD+H2OHorseradishperoxidase,HRPC含有吸附和共价结合的HRP,经过洗涤之后N峰下降由于HRP的血红素辅基埋在分子内部,如果能够引入一个分子导线到氧化还原中心将能促进电子传递.8.3.7血红蛋白(hemogbobin,Hb)血红蛋白的相对分子质量为65000,四聚体,含有两个亚基和两个亚基,每个亚基含有一个亚铁血红素,分开的亚基没有功能.在胎儿时期,细胞表达亚基而不表达亚基.出生之后,亚基取代亚基.Hb存在于红细胞中,在高氧分压环境(如肺部)摄取氧分子,而后在低氧分压环境中释放氧,提供给组织和细胞,以维持细胞能量代谢.血红素蛋白还参与红细胞高铁血红素的还原,以在血液循环中使生理性高铁血红素维持低水平.tetraethylorthosilicate(TEOS)四乙基正硅酸盐8.3.8肌球蛋白(myoglobin,Mb)肌球蛋白是一种水溶性蛋白,相对分子量约为17000,它与血红蛋白都属于血红素蛋白,但为单体,含有一个亚铁血红素基团,能与氧结合.主要存在与哺乳动物肌肉中,在细胞内起贮存和传递氧作用.在细胞缺氧时,氧化Mb释放结合的氧供代谢用途.Mb分子的血红素插入分子裂隙的疏水区.在体内,Mb一般为还原态,当血红素的四吡咯环和裂隙中疏水氨基酸界面的相互作用使蛋白质结构稳定.CO也能结合,结合的方式与氧结合方式类似,但结合更加牢固,这也就是煤气中毒的原因.图8-11鲸鱼精肌球蛋白的三维结构Mb在裸电极上的电子传递速率很慢,需要对电极进行修饰.用阳离子表面活性剂修饰电极效果比较好,应用比较多.阳离子表面活性剂能够以特定方式与电极表面结合,并将Mb以合适的空间取向锚定,利于电子传输.蛋白质在金属或是没有处理的电极上电子转移非常慢,但是在用表面活性剂处理后的电极上展现很好的电子转移能力.8.3.9双功能亚铁血红素-酶类许多天然氧化还原酶含有两个氧化还原活性中心,属于非蛋白基团(prostheticgroup),它们构成蛋白质的电子转移通道.这类酶是唯一一类可以进行研究外源电子传递和内部电子传递及其调控的酶类.纤维二糖脱氢酶(cellobiosedehydrogenase,CDH)就是一例.CDH是将解纤维木质真菌的胞外酶,以白腐真菌CDH研究得最广泛.该酶催化纤维二糖、乳糖和纤维糊精的氧化。酶的‘头部’含有黄素辅酶FAD，‘尾部’含有亚铁血红素。对这两个部位研究发现，FAD域参与糖氧化步骤，并随之还原双电子受体。然而在单电子受体情况下，酶的亚铁血红素域将电子从黄素酶FAD有效地传递到单电子受体。(a)(b)图8-12真菌纤维二糖脱氢酶的三维结构纤维二糖图8-15铜绿假单胞菌醌蛋白乙醇脱氢酶三维结构二聚体，每个亚基含辅酶PQQ图8-16细菌葡萄糖脱氢酶三维结构8.3.10PQQ-酶以吡咯喹啉苯醌(pyrrolequinolinequinon,PQQ)为辅酶的酶属于醌蛋白(quinoprotein)，发现较晚，多属于脱氢酶。它们与FAD-脱氢酶类似，可以催化多种底物的氧化反应，包括糖、醇、胺和醛类。在生理条件下，这些酶的电子受体不是嘌呤核苷酸，而是一些可溶性氧化还原蛋白。因此，醌蛋白PQQ酶类可以参与长距离的电子传递。PQQ-酶能够在电极上进行直接电氧化，底物转换发生在PQQ活性部位的和电子传递通过蛋白质分子传递到亚铁血红素氧化还原部位，再进一步到电极。8.4直接电化学酶电极研究进展8.4.1纳米颗粒在直接电化学电极中的应用纳米颗粒在生物传感器中的应用非常广泛,可以分为如下几类:1)纳米颗粒标记可以用于生物分子的标记,从而实现信号放大(金银,量子点,磁性颗粒).2)纳米颗粒用作固定载体纳米粒子具有高的比表面积,用于生物分子的固定可以增加固定的分子数量,从而增强反应信号;纳米材料固栽酶或蛋白质后还可以增强它们的稳定性,利于其电子传输.3)作为一种新型的智能聚合物,聚丁二炔类化合物引起人们的广泛注意.通过掺杂丁二炔单体,两亲性的磷脂纳米颗粒小体在紫外照射下聚合,形成稳定的微组装结构.在聚丁二炔的头端修饰上具有特异识别功能的生物分子,在溶液状态下,待测分子的结合拉动聚丁二炔纳米颗粒的结构变化,从而产生肉眼可见的蓝-红颜色变化.酶插头:将黄素辅酶FAD修饰1.4nm直径的金纳米晶体,使其功能化并与黄素原酶和葡萄糖氧化酶原酶重组,然后整合到导电膜中,形成生物电催化系统.该重组系统的电子转移转换速率大约为5000个/s.而天然酶的天然底物分子氧接受电子的速率为700个/s.金纳米颗粒如同电纳米插头,起到酶氧化中心的导线作用.8.4.2过氧化物酶在电极上的重构8.4.3自组装双层脂膜直接电化学电极采用超分子组装方法,通过聚丁二炔与金电极上自组装十八烷硫醇单层膜的结合,形成基本传感器原理.用该传感器研究大肠杆菌与甘露醇之间的生物学相互作用.8.4.5一次性受体直接电化学传感器’受体通过其疏水末端与膜相互嵌合,其亲水端朝向反应溶液,形成直接电化学测定神经性物质的一次性传感器.对多巴胺和麻黄碱响应时间为8-20秒,如果膜中不含有受体,仍然可以对多巴胺响应,但响应时间为3min,且对麻黄碱不响应.8.4.6高铁血红素的直接电化学传感器在离子液体中研究氯高铁血红素的直接电化学行为.8.4.7蛋白膜伏安法在常规的伏安实验中,蛋白质是分散在溶液中的,常常难以获得直接电化学