生物安全实验室操作规范

生物安全实验室规范操作技术天津市卫生防病中心苏旭2005年6月生物安全实验室操作技术规范实验室事故、伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误、不良实验技术以及仪器使用不当造成的，实验室样品的收集以及内部传递和接收不当时，都能够带来使相关人员感染的危险。应建立完善的管理制度与操作细则，避免或尽量减少这类问题的发生。实验室中样品的安全操作样品容器样品容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品。样品容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地张贴标签以便于识别。样品的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。样品在设施内的传递为了避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有样品的容器保持直立。二级容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。实验室中样品的安全操作实验室中样品的安全操作样品接收需要接收大量样品的实验室应当指定专门的房间或空间。实验室中样品的安全操作打开包装接收和打开样品的人员应当了解样品对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用常规预防措施的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。样品要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。移液管和移液辅助器的使用应使用移液辅助器。所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。不能向含有感染性物质的溶液中吹人气体。感染性物质不能够用移液管反复吹吸混合。不能将液体从移液管内用力吹出。刻度对应移液管不需要吹出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。移液管和移液辅助器的使用污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡18-24小时后再进行处理。盛放废弃移液管的容器应当放在生物安全柜内，而不能放在外面。移液管和移液辅助器的使用固定有皮下注射针头的注射器不能够用于移液。应当用钝头导管替代针头。可以用工具打开瓶塞后再用移液管取样，从而避免使用注射器和针头。为了避免感染性物质从移液管中意外滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其高压灭菌或按感染性废物处理。避免感染性物质的扩散为了避免转移物质洒落，微生物接种环的直径应为2—3mm并完全封闭，手柄的长度应小于6cm以减小振动。或者采用一次性灭菌棉签。使用封闭式微型电加热器消毒接种环能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。避免感染性物质的扩散为了避免产生气泡和气溶胶的扩散，不要在玻片上进行触酶试验，而应当采用试管、毛细管或盖玻片法。准备高压灭菌和／或处理的废弃样品和培养物应当放置在防漏的容器内，如实验室废物袋。在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。生物安全柜的使用应参考国家标准和相关文献，理解生物安全柜的使用方法和局限性。并发给工作人员书面的操作步骤、安全或操作手册。应明确注明当出现溢出、破损或不良操作时，安全柜就不再能保护操作者。生物安全柜必须运行正常时才能使用。生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。生物安全柜的使用安全柜内应尽量少放置器材或样品，不能阻碍后部的气流循环。样品在放人安全柜内的工作区前需要清除表面污染。安全柜内使用酒精灯，应考虑燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环。所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过观察挡板看到。尽量减少操作者身后的人员流动。生物安全柜的使用操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。实验记录、移液管以及其他物品不能够阻碍前面的空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5分钟。血清的分离只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。。移液管使用后应完全浸入次氯酸盐或其他适当的消毒液中。移液管应在消毒液中浸泡至少18小时，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。带有血凝块等的废弃样品管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌和／或焚烧。离心机的使用在使用实验室离心机时，仪器良好的机械性能是保障微生物安全的前提条件。应按照操作手册来操作离心机。离心机放置的高度应当使低于平均身高的工作人员也能够看到离心机腔体内部，以正确放置十字轴和离心管套。离心管和盛放离心样品的容器应当由厚壁玻璃制成，或最好为塑料制品，并且在使用前应检查是否破损。离心机的使用用于离心的试管和样品容器应当始终牢固盖紧(最好使用螺旋盖)。离心管套的装载、平衡、密封和打开必须在生物安全柜内进行。离心管套和十字轴应按重量配对，并在装载离心管后正确平衡。离心机的使用对于危险度三级和四级的微生物，必须使用可封口的离心离心管套(安全杯)。当使用固定角离心转子时，必须小心不能将离心管装得过满，否则会导致漏液。应当每天检查离心机内转子部位的腔壁是否被沾染或弄脏。如污染明显，应重新评估离心操作规程。离心机的使用应当每天检查离心转子和离心管套是否有腐蚀或细微裂痕。每次使用后，要清除离心管套、转子和离心机腔的污染。使用后离心管套应当倒置存放使平衡液流干。当使用离心机时，可能喷射出可在空气中传播的感染性颗粒。如果将离心机放置在传统的前开式的I级或Ⅱ级生物安全柜内，这些粒子由于运动过快而不能被安全柜内的气流截留。而在Ⅲ级生物安全柜内封闭离心时，可以防止生成的气溶胶广泛扩散。但是，良好的离心操作技术和牢固加盖的离心管可以提供足够的保护，以防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生。匀浆器＼摇床＼搅拌器和超声处理器的使用实验室不能使用家用(厨房)匀浆器，因为它们可能泄漏或释放气溶胶。使用实验室专用搅拌器和消化器更为安全。盖子、杯子或瓶子应当保持正常状态，没有裂缝或变形。盖子应能封盖严密，衬垫也应处于正常状态。在使用匀浆器、摇床和超声处理器时，容器内会产生压力，含有感染性物质的气溶胶就可能从盖子和容器间隙逸出。由于玻璃可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者，建议使用塑料容器，尤其是聚四氟乙烯容器。匀浆器＼摇床＼搅拌器和超声处理器的使用使用匀浆器、摇床和超声处理器时，应该用一个结实透明的塑料箱覆盖设备，并在用完后消毒。可能的话，这些仪器可在生物安全柜内覆盖塑料罩进行操作。操作结束后，应在生物安全柜内打开容器。应对使用超声处理器的人员提供听力保护。自动化仪器(超声处理器、涡旋混合器)为了避免液滴和气溶胶的扩散，这些仪器应采用封闭型的。排出物应当收集在封闭的容器内进一步高压灭菌和／或废弃。在每一步完成后应根据操作指南对仪器进行消毒。组织研磨器的使用使用玻璃研磨器时应戴手套，并用一块具有吸收性的软物包住研磨器。塑料(聚四氟乙烯)研磨器更加安全。操作和打开组织研磨器时应当在生物安全柜内进行。冰箱与冷柜的维护和使用冰箱、低温冷柜和干冰柜应当定期除霜和清洁，应清理出所有在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护，清理后要对内表面进行消毒。储存在冰箱内的所有容器应当清楚地标明内装物品的学名、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃。应当保存一份冻存物品的清单。除非采用有效防爆措施，否则冰箱内不能放置易燃溶液并冰箱门上应明确标示。装有冻干感染性物质安瓿的开启当打开装有冻干物的安瓿时必须小心，因为其内部可能处于负压，瞬间进入的空气可能使一些物质扩散进入空气。安瓿应该在生物安全柜内打开，建议按下列步骤打开安瓿：首先清除安瓿外表面的污染。如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。用一团酒精浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。将顶部小心移去并按污染物处理。如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去。缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物，避免出现泡沫。装有感染性物质安瓿的储存装有感染性物质的安瓿不能浸入液氮中，因为这样会造成有裂痕或密封不严的安瓿在取出时破碎或爆炸。如果需要，安瓿应当储存在液氮上面的气相中。感染性物质应储存在低温冰柜或干冰中。当从冷冻储存器中取出安瓿时，实验室工作人员应当进行眼睛和手的防护。以这种方式储存的安瓿在取出时应对外表面进行消毒。样品的收集、标记和运输始终遵循常规预防措施；所有操作均要戴手套应当由受过培训的人员来采集病人或动物的血样。在静脉抽血时，应当使用一次性的安全的抽真空设备取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和／或培养管中。用完后自动废弃针头。装有样品的试管应置于适当容器中运至实验室，在实验室内部转运也应这样说明书应当分开放置在防水袋或信封内。用于显微观察的薄膜和涂片用于显微观察的血液、唾液和粪便样品在固定和染色时，并不必杀死涂片上的所有微生物和病毒。应当用镊子拿取这些东西，恰当储存，并经清除污染和／或高压灭菌后再丢弃。组织样品组织样品应当采用福尔马林固定。小块样品，如针头活检样品，能够在几个小时内固定和消毒，但是较大样品则可能需要几天时间。应当避免冰冻切片。如果必须进行冰冻切片，应当罩住冰冻机，操作者要戴安全防护罩。清除污染时，仪器的温度要升至20℃。生物安全实验室消毒与灭活消毒和灭菌的基本常识对于实验室生物安全是至关重要的。生物安全中关于清除污染的特殊要求要根据实验工作的类型和所操作感染性物质的特性来决定。因此，有必要利用已知的普通信息来确立更具体的和标准化的程序，以满足某些特殊实验室中各种不同生物危害水平的需求。清除局部环境的污染清除表面污染时可以使用次氯酸钠(NaC1)溶液；含有1％有效氯的溶液适于普通的环境卫生设备，但是当处理高危环境时，建议使用高浓度(5g/L)溶液。用于清除环境污染时，含有3％过氧化氢的溶液也可以作为漂白剂的代用品。清除局部环境的污染可以用福尔马林所产生的甲醛蒸气熏蒸来清除房间和仪器的污染。产生甲醛蒸气前，房间的所有开口(如门窗等)都应用密封带或类似物加以密封。熏蒸应当在室温不低于21℃且相对湿度70％的条件下进行清除污染时气体需要与物体表面至少接触8小时。熏蒸后，该区域必须彻底通风后才能允许人员进入。在通风之前需要进入房间时，必须戴适当的防毒面具。可以采用气态的碳酸氢铵来中和甲醛。已有报道，可采用过氧化氢溶液的气雾熏蒸污染的空间，但对此还需要进一步的研究。生物安全柜污染的清除清除I级和Ⅱ级生物安全柜的污染时，应当将适量的多聚甲醛(空气中的终浓度达到0.8％)放在电热板或电热盘上(在生物安全柜外进行控制)。然后在生物安全柜内放置第二个放有比多聚甲醛多10％的碳酸氢铵的加热板或盘。第二个盘上覆盖一个能够从远处将其移走的盖子(如连接一个能够从生物安全柜外拉动的绳子)，从而尽量减少对甲醛气体的提前中和。如果相对湿度低于70％，在使用强力胶带密封前部封闭板前，还要在安全柜内部放置一个开口的盛有热水的容器。如果前部没有封闭板，则可以用重型塑料布粘贴覆盖在前部以保证气体不会泄漏进入房间。生物安全柜污染的清除打开多聚甲醛盘的加热开关，1小时后或多聚甲醛完全蒸发后关闭。让生物安全柜静置过夜。移去第二个盘子的盖后打开加热开关，让碳酸氢铵挥发。然后，关闭开关并启动安全柜让碳酸氢铵气体循环1小时。移去前封闭板(或塑料布)后就可以使用生物安全柜了。洗手／清除手部污染接触生物危害性材料时，必须戴合适的手套。接触过生物危害性材料和动物后、使用过卫生间后、离开实验室前以及吃东西前都必须洗手。大多数情况下，用普通的肥皂和水彻底冲洗对于清除手部污染就足够了。但在高度危险的情况下，建议使用杀菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10秒钟，用干净水冲洗后再用干净的纸巾或毛巾擦干(如果有条件，也推荐使