实验二十-感受态细胞的制备及外源基因导入

实验二十感受态细胞的制备及外源基因导入[原理]转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R-、M-符号表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2、MgCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant）即带有异源DNA分子的受体细胞。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用MgCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC19质粒共保温，实现转化。pUC19具抗氨苄青霉素的特性即Ampr，将转化后的全部受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。[试剂]1.1、E.coliDH5α受体菌：R-、M-、Amps2.pUC19质粒3.5×LB培养基4.100μg/ml氨苄青霉素5.含氨苄青霉素的LB平板培养基6.TSS将10%PEG8000、5%DMSO、20mmol/LMgSO4，各成分溶于100mlLB培养液中，过滤除菌。7.含20mmol/L葡萄糖的1×LB[器材]1.恒温摇床2.电热恒温培养箱3.无菌操作超净台4.电热恒温水浴箱5.紫外分光光度计6.离心机7.塑料离心管8.移液器[操作步骤]1.大肠杆菌感受态细胞的制备（1）从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（2）取50μl该菌悬液接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡1~2h，当培养液开始出现混浊，停止培养。（3）将1ml细菌加入1个1.5ml塑料离心管中，12000rpm离心2min沉淀细菌，弃去上清。（4）将细胞重悬于100μlTSS缓冲液中。2.细胞转化（1）在上述细胞悬液中，加入pUC19质粒DNA（含量不超过50ng）。此管为转化实验组。其他管按下表进行N0.质粒DNA/μl（pUC19）感受态细胞/μl无菌水/μl1×TSS/μl样品2100对照11002对照22100（2）将各样品轻轻摇匀，冰上放置10min。（3）加0.9ml含20mmol/L葡萄糖的TSS溶液，于37℃振荡培养1h。5000r/min离心5min，弃去900μl，将沉淀混匀。（4）将细胞悬液铺布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上。平板于37℃孵箱正放30min，然后倒置。（5）平板于37℃孵箱过夜。（6）次日观察菌落生长情况，筛选。