高效液相色谱

仪器分析INSTRUMENTALANALYSIS教师：谢宝平液相色谱法LC以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法LiquidChromatography3按分离机制液相色谱法类型吸附色谱分配色谱离子交换色谱空间排阻色谱按操作形式液相色谱法类型柱色谱填充柱色谱；整体柱色谱平面色谱纸色谱薄层色谱薄膜色谱毛细管电色谱按分离效能经典液相色谱现代液相色谱液相色谱法类型经典液相色谱:常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法经典柱色谱法平面色谱法现代液相色谱:高压输液泵输送流动相—高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography第一节、概述高效液相色谱（HPLC）：高效能固体细微粒为固定相高压输送流动相高灵敏度检测器一、含义二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典LC的比较经典LCHPLC固定相颗粒100μm,不均匀固定相颗粒10μm,均匀常压下输送流动相高压下输送流动相柱效较低（H↑，n↓）柱效较高（H↓，n↑）分析周期长分析周期短无法在线检测可以在线检测2.HPLC与GC的比较分析对象及范围流动相的选择操作条件GC适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC能制成溶液的样品，不受试样的挥发性和热稳定性限制，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行相同：均为色谱分析法，兼具分离和分析功能，均可在线检测•按固定相的聚集状态分类：液-固色谱法液-液色谱法三、HPLC分类按流动相和固定相特征分为正相色谱反相色谱按分离目的分为分析型制备型•其它分离机制色谱法：–亲合色谱法–胶束色谱法–手性色谱法–毛细管电色谱法三、HPLC分类当前最常见的HPLC分离机制：化学键合相色谱法按分离机制分类：基本分离机制：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量各种HPLC方法的应用范围及对象80%以上的有机物可用HPLC分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物分析，显示出优势。第二节HPLC仪器进样系统检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合器高压输送流动相高效固定相在线检测高灵敏检测器第二节HPLC仪器高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置进样系统：进样器，进样阀分离系统：色谱柱，恒温箱检测系统：检测器记录系统：记录装置、色谱工作站1、贮液器和吸滤器：一、高压输液系统贮液器:0.5-2L的玻璃瓶溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45m，防止颗粒物进行泵内。2、高压输液泵一、高压输液系统要求流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min耐高压：输出压力常达30-60MPa液流稳定。结构材料应耐化学腐蚀活塞型往复泵——液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵双活塞型往复泵防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相须先脱气高压输液泵操作注意事项一、高压输液系统离线超声波振荡脱气在线惰性气体鼓泡吹扫脱气在线真空脱气装置3、脱气装置：将分子量较小的气体从溶剂中除去洗脱技术等度洗脱:在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。等度洗脱：适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。洗脱技术梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比。梯度洗脱：适合于用来分析组分数目多、性质相差较大样品。梯度洗脱优缺点：•能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度。•可能引起基线漂移，重现性降低。一、高压输液系统4、梯度洗脱装置：高压梯度低压梯度一、高压输液系统高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器一、高压输液系统低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。二、进样系统将样品溶液准确送入色谱柱的装置常用手动进样器——六通阀进样器，——手动方式、自动方式样品定量管二、进样系统六通阀进样LoadInject自动进样器三、色谱柱柱类型管内径柱长填料粒径流速检测池体积（mm）(cm)(um)(ml/min)(ul)常规2-510-255-100.5-2小于10快速2-53-532-5小于3微径0.5-110-301-30.1-1小于1分为常规、快速、微径柱四、检测系统用于连续监测色谱柱流出物的组成和含量变化。专属型检测器：紫外、荧光、电化学检测器通用型检测器：示差折光，蒸发光散射检测器1、紫外检测器工作原理：紫外可见分光光度法应用最广泛的检测器用于有紫外吸收的物质检测，对流动相有限制。固定波长检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液可变波长检测器固定波长检测器：214nm、230nm、254nm、280nm光电二极管阵列检测器2、荧光检测器用于能产生荧光的物质检测工作原理：荧光分析法3、电化学检测器电导检测器：——用于离子检测用于检测具有电活性的物质接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)3、电化学检测器用于检测具有电活性的物质安培检测器：——用于检测具氧化还原活性物质4、蒸发光散射检测器适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品检测通用型检测器5、示差折光检测器适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品检测通用型检测器检测器类型品种个数紫外检测器1333个蒸发光散射检测器28个示差检测器10个电导检测器5个2010版药典二部采用检测器情况五、数据处理和计算机控制系统色谱工作站在线显示自动采集处理储存自动控制粒径小、颗粒分布均匀传质快、渗透压小机械强度高、能耐高压化学稳定性好第三节、HPLC的固定相和流动相一、固定相要求：载体硅胶：用于吸附、分配和键合色谱聚合物：用于离子交换和尺寸排阻色谱以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上。（一）化学键合固定相HClSiROSiSROHSiRSiClSiOHSiROSiOHROHSiSOClSOCl33RMgClRLiiCl)()()(22硅烷化酰氯化硅酯化或Si-O-R：热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性较好。pH4-8之间对水稳定。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定（一）化学键合固定相非极性键合相：用于反相色谱十八烷基键合相（C18）辛烷基键合相（C8）甲基键合相（C1）（一）化学键合固定相中等极性键合相：用于反相或正相色谱醚基键合相二羟基键合相极性键合相：一般用于正相色谱氨基、氰基键合相键合型离子交换剂：硅胶表面键合各种离子交换基团（二）其它种类固定相手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体二、流动相——淋洗液，洗脱剂对样品有适宜溶解度，k=2~5；溶剂要与检测器匹配。高纯度、化学稳定性好适宜的粘度。过高柱压增加；过低易生气泡流动相要求常用的低粘度溶剂：甲醇、乙晴等粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等流动相的类别按流动相组成分：单组分和多组分。按极性分：极性、弱极性、非极性。按使用方式分：恒组成洗脱和梯度洗脱。常用溶剂:正已烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。流动相选择溶剂的极性是选择的重要依据溶剂强度：指流动相将组分从色谱上洗脱下来的能力，其值越大，组分的K越小，保留值越小。正相色谱——极性固定相——流动相极性越强——洗脱能力越强——强极性溶剂是强溶剂反相色谱——非极性固定相——流动相极性越弱——洗脱能力越强——弱极性溶剂是强溶剂有机溶剂极性表化合物名称极性化合物名称极性正戊烷0乙酸乙酯4.30己烷0.06氯仿4.4四氯化碳1.6丙酮5.4苯3乙酸6.2二氯甲烷3.4乙腈6.2正丁醇3.7甲醇6.6乙醇4.3水10.2正相洗脱时，水的洗脱能力最强反相洗脱时，水的洗脱能力最弱流动相对分离的影响二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性以改善分离或调整出峰时间。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况增加流动相中强溶剂比例，其洗脱能力增强，k变小如：MobilePhase：H2O（A）-CH3CN（B）如：MobilePhase：H2O（A）-CH3CN（B）如：MobilePhase：H2O（A）-CH3CN（B）如：MobilePhase：H2O（A）-CH3CN（B）常用的溶剂:正己烷、氯仿、二氯化碳等可用醇类调节极性及溶解性能。正相HPLC流动相的选择正相色谱：极性柱（正相柱）——极性固定相——非极性流动相（加极性调节剂）常用溶剂：水、甲醇、乙醇、乙腈等可用醋酸、磷酸调节pH值用三乙胺作为碱性添加剂改善色谱峰的形状反相HPLC流动相的选择反相色谱：非极性柱（反相柱）——非极性键合固定相（ODS）——极性流动相选择流动相时应注意的几个问题使用高纯度试剂作流动相，使用前须用微孔滤膜过滤防止固体颗粒堵塞流路，还要进行脱气。避免流动相与固定相发生作用损坏柱子。试样在流动相中应有适宜的溶解度，以防在柱中沉积。流动相还应满足检测器的要求。第四节HPLC方法及原理一、反相键合相色谱法二、正相键合相色谱法三、离子键合相色谱法四、反相离子对色谱法五、亲和色谱法一、反相键合相色谱法（RPBPC）固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-辛烷基等流动相：采用极性较强的溶剂，一般以水为基础溶剂，加入一定量的极性调整剂。常用甲醇-水、乙睛-水等分离机理——疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相——硅胶表面的十八烷基“分子毛”——较强的疏水特性。一、反相键合相色谱法（RPBPC）分子中非极性部分——疏水烷基——缔合作用，分子保留分子极性部分——极性流动相——离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为同系物中，碳数越多，K越大引入极性基团，K值变小引入非极性基团，K值变大增加水的含量，K值变大溶质的离解程度越高，K值越小，可加入少量弱酸碱抑制解离，提高分离效果——离子抑制色谱溶质分子的结构：流动相：影响溶质保留的因素一、反相键合相色谱法（RPBPC）改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。用途一、反相键合相色谱法（RPBPC）主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面二、正相键合相色谱法（NPBPC）流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）分离机理：通常认为属于分配过程用途：多用于分离极性或中等极性化合物三、离子键合相色谱法固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H流动相：一般采用缓冲溶液。分离原理：与离子交换色谱类同用途：多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等离子对水相水相BABA离子对AB具有疏水性，被非极性固定相提取不同待测离子A1，A2…与B离子间成对能力不同，形成不同疏水性离子对，从而保留值不同原理：四、反相离子对色谱法（RP-IPC）固定相为非极性键合相，流动相为含水溶液用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱常用离子对试剂：分离酸类和带负电荷物质，常用季铵盐分离碱类和带正电荷物质，常用烷基磺酸盐五、亲和色谱法（AC）原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离固定相：生物专一性配基+载体流动相：一定pH的缓冲液具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作