体液免疫球蛋白测定

第十六章体液免疫球蛋白测定P188湖南省中医药大学微生物免疫教研室李志芳抗体（antibody,Ab)：是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的能与相应抗原特异性地结合球蛋白。(生物学功能上的概念)抗体主要存在于血清等体液中，故将抗体介导的免疫称为体液免疫。几个概念免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。（化学结构上的概念）Ab与Ig的联系1.所有的Ab都是Ig2.Ig并非都是Ab分泌型（secretedIg，sIg）：存在于血清等体液中，如Ab膜型（membraneIg，mIg）是B细胞上的抗原受体。Ig的基本结构：四肽链结构,所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。免疫球蛋白分类及特性重链性质，Ig分5类：IgG(γ)、IgA(α)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)轻链性质，Ig分2型：κ、λIg占血浆蛋白总量：20%Ig含量：血清IgG、IgA、IgM：g/L、IgD、IgE：mg/L体液IgG、IgA、IgM：mg/L检测意义：反应机体的免疫功能、诊断疾病五类免疫球蛋白的特点和功能IgG1IgG2IgG3IgG4IgMIgA1IgA2IgDIgE重链123412主要存在形式单体单体单体单体五聚体单体、双体单体单体经典途径活化补体+++++++++穿过胎盘++++++结合吞噬细胞+++++++++结合肥大细胞和嗜碱粒细胞+++与SPA结合+++NK细胞介导的ADCC++++免疫作用抗感染、自身抗体早期防御作用粘膜局部免疫B细胞成熟标志I型超敏反应第一节体液中IgG、IgA、IgM测定的临床应用体液免疫球蛋白测定主要指对人体的血液、尿液、脑脊液等样本中的IgG、IgA、IgM定量检测，由于免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在人体体液中含量相对较高，测定快速，临床意义明确，临床应用较广泛IgG是血清中含量最高(占80%)的免疫球蛋白，是血液和细胞外液中的主要抗体，也是机体再次免疫的主要抗体。IgA分为血清型A1和分泌型A2，是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，也是抗原刺激诱导的体液免疫应答中最早出现的抗体。测定方法单向环状免疫扩散法(耗时、重复性差)免疫浊度法（速率散射比浊）常用年龄：血液Ig随年龄、性别、血型、种族及测定方法不同有所差别，各实验室要建立自己的参考范围一、血液免疫球蛋白测定的临床意义高Ig血症多克隆Ig增高（感染）单克隆Ig增高（免疫增殖病）低Ig血症:先天性低Ig血症（免疫缺陷病）获得性低Ig血症(蛋白丢失、淋巴系统肿瘤、使用免疫抑制剂)正常人尿液中的Ig含量甚微，当机体的免疫功能异常或炎症反应引起肾脏疾病时，可导致肾小球滤过膜分子屏障破坏或电荷屏障受损，从而引起球蛋白及其他大分子蛋白质漏出增多。二、尿液免疫球蛋白测定的临床意义判断肾小球滤膜受损程度：选择性蛋白尿指数SPI可根据尿内Ig增高的类型帮助鉴别诊断肾小球疾病的种类尿中游离轻链的检测对诊断轻链病和MM有重要意义三、脑脊液免疫球蛋白测定的临床意义生理情况下，Ig根据其分子量大小，通过血脑屏障的难易度不同，IgG、IgA、IgM在脑脊液中的浓度递减。病理状态时，血脑屏障通透性增加，脑脊液组分发生改变。血脑屏障受损程度：白蛋白商值、CSF-IgG指数增高有临床意义：多发性硬化症、中枢神经系统感染第二节血液IgD和IgE的测定及临床应用正常人血液中IgD含量很低（0.2%），目前生物学功能尚不清楚IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，引起I型超敏反应；与机体抗寄生虫免疫也可能有关。一、IgD的测定及临床意义测定方法：放免、免疫比浊、ELISA(常用)临床意义：血液中含量波动范围大，各实验室最好使用固定的试剂盒，建立自己的参考范围二、IgE的测定及临床意义测定方法：总IgE测定：放射免疫分析法化学发光免疫分析法(常用)免疫比浊法酶联免疫吸附法(常用)特异性IgE测定：免疫斑点法酶联免疫吸附法临床意义：增高：变态反应性疾病、寄生虫感染、病毒感染、自身免疫性疾病。降低：意义不大第三节血清IgG亚类测定及临床意义Ig亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，其含量依次下降测定方法：单向免疫扩散法免疫比浊法（常用）放射免疫分析法酶联免疫吸附法（常用）临床意义：IgG亚类可能和感染复发、免疫缺陷和自身免疫性疾病有关，因而测定IgG亚类对上述疾病有重要意义。即使当总IgG水平在正常范围内，IgG的亚类分配也可能发生紊乱第四节M蛋白测定及临床意义M蛋白：B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常单克隆免疫球蛋白临床上多见于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等M蛋白测定蛋白区带电泳：经典方法计算蛋白含量和百分比免疫比浊法：免疫球蛋白定量准确性高、快速免疫电泳：M蛋白分型免疫固定电泳：M蛋白分型及鉴定，分辨率高(最常用)各方法视具体情况合理选用蛋白质区带电泳是血清蛋白的经典分析方法，血清（或尿液）标本中不同性质的蛋白质由于其等电点，分子量和分子形状各不相同，其电泳速度就不同，可明显分开形成不同的区带，与正常的电泳图谱进行比较，很容易发现患者电泳图谱中不一样的狭窄而浓缩的集中带，即M区带。这是由于M蛋白的化学结构高度均一，因而其电泳迁移率十分一致。如果将这些区带电泳图谱扫描，还可计算出异常蛋白的含量和百分比。这种M区带较多见于γ或β区，偶亦可见于α区。该法方便，是筛选M蛋白的最基本方法。但是区带电泳不能判定免疫球蛋白的类型，最终还需用特异性抗体进行鉴定。一、血清蛋白区带电泳b2白蛋白1:1酸性糖蛋白,1抗胰蛋白酶:结合珠蛋白,2巨球蛋白,脂蛋白,铜蓝蛋白:转铁蛋白,血液结合素,C3补体,b脂蛋白:免疫球蛋白血清蛋白电泳正常的电泳图谱出现在β区域的单克隆免疫球蛋白二、血清免疫球蛋白定量测定血清免疫球蛋白定量测定也可作为检测M蛋白的初筛试验。免疫球蛋白定量测定较常用的方法有单向扩散法与免疫浊度法，前者较为简便，后者更为准确迅速免疫球蛋白定量检测，有助于丙种球蛋白病的诊断，并对丙种球蛋白病的良、恶性鉴别有帮助。恶性单克隆丙种球蛋白病常呈现某一类丙种球蛋白的显著增高，大多在30g/l以上；在良性丙种球蛋白病的血清标本中，M蛋白多在20g/l以下三、免疫电泳（常规方法）疑为丙种球蛋白病的患者，经血清蛋白区带电泳和免疫球蛋白测定，已基本证实是否有免疫球蛋白的异常增高和其含量的多少，但是增高的M蛋白究竟是哪一类免疫球蛋白，仍需进一步分类鉴定，常应用各种类型的特异性抗血清，做不同形式的电泳或免疫扩散。免疫电泳是将区带电泳和免疫扩散结合起来的一种免疫学分析法。一般多用抗IgG、IgM、IgA、κ和λ轻链等5种抗血清进行实验，用抗正常人血清作为对照。M蛋白与相应抗体发生反应所出现的沉淀弧较为特殊，较普通沉淀弧宽，凸出呈弓形，不难辨认+-免疫电泳示意图四、免疫固定电泳（最常用）区带电泳+沉淀反应：将待测血清或其他标本在琼脂平板上作区带电泳，分离后于其上覆盖含抗κ或λ轻链或各类重链的抗血清滤纸，当抗体与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合后，便形成复合物而沉淀下来，再通过漂洗与染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆丙种球蛋白的轻链和重链型别结合蛋白质电泳的高分辨率和抗原抗体反应的特异性测定时间短(1.5-2h)、敏感性高（0.5-1.5g/l）、结果直观易于分析判断左图为IgGκ型,中图为IgGλ型，右为正常SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定电泳示意图五、本-周蛋白的检测本周蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链，其检测对轻链病的诊断是必不可少的项目，并对多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白病、重链病等疾病的诊断、鉴别和预后判断均有一定帮助加热沉淀法:本周蛋白在pH5.0的条件下，加热至50℃～60℃时出现沉淀，继续加热至90℃后又重新溶解。根据这种理化性质，又将其称为凝溶蛋白，故可根据这一特点，用化学方法进行检测。这种方法简便易行，但敏感度较低，也不能确定轻链的型别免疫电泳分析法：尿标本用抗κ和λ型轻链抗血清进行免疫电泳分析，游离轻链往往与其中一型的抗血清起反应，在β-γ区附近形成一条致密的弓形沉淀弧。六、κ-Ig和λ-Ig定量测定样本：尿液、血液方法：单向免疫扩散法、免疫比浊法（常用，准确、快速）应用：M蛋白血症的分型及鉴定多数实验室确立的κ/λ比率正常范围在1.2-2.4，通过κ/λ比率测定有助于判断疾病类型和监测治疗效果冷球蛋白是血清中的一种特殊蛋白质，在4℃时自发沉淀，在37℃时又可溶解，常利用这种可逆性冷沉淀的特性对其进行测定。取患者外周血，分离出血清置4℃冰箱中，一般在24～72h出现沉淀，若1周仍不出现沉淀者方可判断为阴性。如形成沉淀，再置37℃温育使其复溶，也可将冷沉淀物离心洗涤后做定性与定量分析。七、冷球蛋白的检测冷球蛋白的类型及临床意义I型：为单克隆冷球蛋白型，占25%～40%;多见于免疫增生性疾病如MMⅡ型：单克隆和多克隆混合型冷球蛋白，占15%～25%;多见于自身免疫性疾病（SLE、类风湿、SS）Ш型：多克隆混合型冷球蛋白，约占50%;多见于传单以及感染性疾病谢谢！