29酶工程复习要点

1名词解释：酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行的催化反应的酶固定化活细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢固定化原生质体：固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体。膜分离技术：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。酶促破碎法：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法。结晶：是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。萃取分离：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。肽链有限水解修饰：肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解。利用肽链的有限水解，其分子质量减少，既可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失，又可以使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。原生质体融合育种：就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组的方法进行育种基因工程育种：改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型。增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产诱导酶与组成酶组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象反馈阻遏：酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象反馈抑制：是最终产物抑制作用，在合成过程中，有些微生物合成途径的终点产物对该途径酶的活性调节，所引起的抑制作用。发酵动力学：研究发酵过程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响的学科。细胞定向进化：是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。酶反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备。固定化酶膜反应器：由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器。2第一章绪论1、何谓酶工程，试述其主要内容和任务。答：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。酶的生产：微生物发酵产酶、动植物培养产酶、酶的提取和分离纯化酶的改性：酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向进化酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。酶工程的内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。酶工程的任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。2、酶有哪些显著的催化特性？答：专一性强、催化效率高和作用条件温和。3、影响酶催化作用的主要因素。一、底物浓度的影响二、酶浓度的影响三、温度的影响四、pH的影响五、抑制剂的影响六、激活剂的影响4、酶活力单位和酶比活力的概念。在实验室规定的条件下，每分钟催化lumol底物变化所需要的酶量为一个酶活力国际单位(用“IU”表示，简写为U)。酶的比活力是指在特定的条件下，单位质量（mg)蛋白质或RNA所具有的酶活单位数。5、如何测定固定化酶的比活力？固定化酶常用的活力测定方法有哪些？在固定化酶中，一般采用每克（g)干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。固定化酶常用的活力测定方法：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法第二章酶的生物合成与发酵生产1、提高酶的产量的措施。（一）遗传控制（一劳永逸）诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株基因工程育种改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型。增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。（二）条件控制3（1）添加诱导物酶的作用底物、作用底物的前体、反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物P50（2）降低阻遏物浓度除去终产物产物阻遏添加阻止产物形成的抑制剂避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富添加一定量的cAMP（3）添加表面活性剂离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80非离子型增加细胞通透性TritonX－100（4）添加产酶促进剂酶促进剂对不同细胞、不同酶的效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度,其作用机制并未阐明清楚。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。2、酶生物合成的模式及每种模式的特征。1．同步合成型特征：生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量合成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。2．延续合成型特征：酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以延续合成一段时间的一种酶生物合成模式。3．中期合成型特征：酶在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。4．滞后合成型特征：酶在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始合成并大量积累。3、影响酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的稳定性高：可在细胞停止生长后继续合成酶差：随着细胞停止生长而终止酶的合成2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开4、优良产酶微生物菌种应具备的条件。酶产量高容易培养和管理（生长速率高、营养要求低）产酶稳定性好利于酶的分离提纯安全可靠，无毒性（不是致病菌）第三章固定化酶41、酶固定化方法有哪几种？各自的特点及适用范围五种方法：热处理法、吸附法、包埋法、共价结合法、交联法热处理法：该法只适应于那些热稳定性较好的酶的固定化。物理吸附法：物理吸附法的优点是操作简单，条件温和，对细胞活性影响小，酶活力损失小等，但细胞易受环境影响而脱落，操作稳定性差，另外，吸附的细胞数量少。包埋法：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。共价结合法：结合牢固，不易脱落，可连续使用较长的时间载体活化操作复杂，对酶的活性有影响。交联法：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基因被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。交联法也用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。2、酶固定化后性质会发生什么变化？原因是什么？酶固定化后稳定性提高中,包括哪几方面的稳定性？（一）酶的活性：通常低于天然酶（有例外）。（二）酶的稳定性酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加，固定化可以增强贮存稳定性和操作稳定性。可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。（三）酶的最适温度最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。（四）酶的最适pH带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH向酸性偏移（五）酶的动力学特征固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。（六）酶的作用专一性与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。3、细胞固定化的方法有哪些？细胞种类多种多样，大小和特征各不相同，故此细胞固定化的方法也有多种。归纳起来，主要可分为吸附法和包埋法两大类方法。吸附法简介：物理吸附法主要是利用细胞与载体之间的静电引力和专一的亲和力作用，使细胞固定在不同的载体（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。包埋法：包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，各种微生物、动植物细胞都可用此方法固定化。一般采用的载体为琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺等。其中聚丙烯酰胺应用最早。5特点：包埋法固定细胞具有很多优点，如：方法简便、条件温和，对细胞活性影响小，稳定性好、机械强度较好和包埋容量较高等。但此法也有缺点，只适用于小分子底物4、简述固定化原生质体的制备方法与特点原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然后采用包埋法制成固定化原生质体。特点：①解除了细胞壁扩散障碍，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。②由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用或连续使用较长时间，利于连续化生产。③易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。④发酵的培养基中需要添加稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可采用层析或膜分离技术等方法与产物分离。⑤固定化原生质由于没有细胞壁，细胞结构不完整，失去增殖能力，但由于细胞膜的结构没有受其影响，保持了细胞原有的新陈代谢特性第四章酶的提取与分离纯化1、细胞破碎的目的、方法。•大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。•机械法•物理法•化学法•酶促破碎法（酶解）2选择细胞破碎方法的依据。•（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。•（2）细胞壁的强度与结构•（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。•（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。•（5）提取分离的难易3.酶抽提的目标及方法。提取目标：•a.将目的酶最大限度地溶解出来。•b.保持生物活性。提取原则•a.相似相溶。•b.远离等电点的pH值，溶解度增加。4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。（2）密度梯度离心特点：：•区带内的液相介质密度小于样品物质•颗粒的密度。•适宜分离密度相近而大小不同的固相6•物质。（3）等密度梯度离心特点：•介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。•适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。5.酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。种类：⑴中性盐沉淀（盐析法）基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。⑵有机溶剂沉淀利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。⑴热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。⑵pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。⑶有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。⑷等电点沉淀原理：蛋白质在等电点时溶解度