HPV病毒的常用通用引物检测

HPV病毒的常用通用引物检测摘要研究表明，HPV病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关。对感染个体的病毒检测具有重要的疾病诊断、治疗、预防意义。但目前缺乏可以兼顾敏感性、特异性、操作简单，可以大规模推广使用的可靠检测方法。对待测样本进行PCR检测仍是目前实验室最多采用的检测方法。PCR具有高敏感、易操作的优点，但其反应的灵活性和极高的敏感性，也带来了假阳性和假阴性的问题。针对HPV病毒L1序列保守区域设计的通用引物检测，最常被应用于大样本检测。通用引物可以在一次PCR反应中同时检测多种型别的HPV病毒感染，与序列特异PCR检测相比，可以大大减少检测的工作量。但其缺点在于，通用引物仅与某个或少数HPV型序列匹配，而对于多数型别HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同。因此，使用通用引物检测HPV感染时，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三类：1）单一引物如：GP5+/6+。2）简并引物如：、MY09/11。3）混合引物如：SPF1/2。个型通用引物都有其各自的优缺点，需要根据特定试验的目的、条件选用合适的通用引物进行检测。【关键词】HPV病毒；通用引物；单一引物；简并引物；混合引物HPV病毒是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，其基因组长约7900bp。目前约共发现约200多型HPV病毒。该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化[1][2][3]。人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV，其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关，如：16、18、31、33、35等，这部分HPV病毒被称为高危型[4][5]。而HPV6、11等型别主要存在于良性病变中，多造成生殖道疣等疾病，被称为低危型[6][7]。但人为区分的高危型和低危型并不是绝对的，因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型HPV[8]。多数HPV病毒对人体的感染都是一过性的，病毒很快会被人体免疫系统清除。但少数情况下，病毒整合入宿主基因组DNA，转变为持续感染[9]。这种感染方式被认为与感染部位的恶性病变相关[10]。接近100％的宫颈癌样本中都可以检测到HPV病毒的存在[11][12]。据估计，每年约290,000人死于宫颈癌。同时每年有490,000例新发宫颈癌病例[13]。因此，对HPV病毒有效的检测方法，将具有重要的临床和社会意义。目前，HPV病毒尚不能人工体外培养，而HPV的血清学检测技术也不成熟。因此，对HPV感染的检测方法仍然局限于使用分子生物学的方法在待测样本中直接检测，如：原位杂交、液相杂交（杂交捕获技术）等[14][15][16][17][18]。但是这些方法不但操作复杂，而且敏感性有限。HPV病毒的PCR检测虽然具备操作简单、高敏感性的优点，但污染严重、容易产生假阳性，因此无法推广到临床应用。目前尚缺乏一种能克服上述所有缺点，同时保持各自优点的成熟检测方式。对于具有严格的污染控制，同时需要高敏感、大样本的检测HPV病毒的实验室，使用PCR检测仍是首选方案。但是鉴于HPV存在如此多的类型，对每一型都使用其特异引物进行PCR检测将是十分巨大量的工作。同时，序列特异PCR只能扩增序列已知的HPV。对于未知HPV型或存在变异的HPV则不能有效扩增检测。因此，人们选取HPV基因组序列中较为保守的L1和E1基因区域设计通用引物，以实现在单一PCR反应中同时检测多种型别HPV的目的[19][20][21]。本文对目前常用的HPV通用引物进行了综述，在各自引物的序列分析基础上，对其优缺点进行了阐述。一、HPV病毒的PCR通用引物检测通常，通用引物的设计遵循三条原则：1）上下有引物均为惟一序列，通用引物只与某一型或少数几型HPV扩增序列完全匹配。在多数HPV型的引物结合区域，通用引物均存在或多或少的碱基错配。使用该种类型的通用引物，应当使用较低的煺火温度，以保证引物可以与存在碱基错配的HPV型结合。这种通用引物的代表为GP5+/6+[22][23]。2）通用引物由一系列简并引物混合而成，这些引物的某些特定位点随机出现两到三种不同的碱基，通过这种方法来弥补不同型别HPV在这些位点的序列差异。简并引物的代表为MY09/11[24]。3）通用引物的上下游均由一系列不同的引物混合构成，这些引物充分考虑了各型HPV在特定位点的序列差异，在混合引物中，尽量存在与各型HPV均达到碱基完全配对的引物。对于某些多数HPV都在此处存在较大的序列差异的位点，这种通用引物在此位点引入肌苷来替代常规的碱基。这一位点的肌苷虽然不能与模板序列形成共价配对，但也不致形成空泡。这种通用引物与各型HPV碱基配对都较好，因此可以采用较严格的PCR条件。其检测效率和敏感性也较高。代表引物为SPF1/2[25]。各种类型的通用引物都存在其各自的优缺点，本文将分别代表性的介绍这三种通用引物。1．GP5/6、GP11/12及GP5+/6+通用引物图1：GP5/6、GP11/12引物序列及其与9型HPV病毒的匹配情况小点表示各型HPV序列与引物序列相同，各型HPV序列与引物序列的差异用相应碱基字母标出GP5/6和GP11/12通用引物由PeterJ.F.Snijders等于1990年发表，其目的是开发一种可以方便、敏感的HPV广谱检测方法[26]。这两对通用引物都扩增HPVL1基因的一段保守序列。其中，GP5/6针对感染生殖道的HPV类型如：HPV6b、16、18、33型，GP11/12针对感染皮肤的HPV类型如：1a、5、8型等。与以往的序列特异引物相比，GP5/6和GP11/12通用引物在大规模检测HPV病毒时具有较显著的优势。它实现了高通量检测，只需通过一次PCR反应，就可以扩增样本中的多种不同类型HPV病毒。虽然该引物只与少数几型HPV病毒序列完全匹配，多数型别的HPV病毒在引物结合区都存在碱基错配，但作者的研究证实，当错配在三个以下时，并不会显著影响PCR的扩增效率。不可否认，使用该通用引物扩增HPV病毒序列存在许多局限性。首先，由于错配序列的存在，引物与模板的结合势必受到影响，这将大大降低PCR扩增的效率。因此，使用这两对通用引物进行PCR扩增时，常常需要使用与平常不同的PCR反应条件。作者推荐了40度的退火温度及3.5到10mM的Mg离子浓度。在这种情况下，尤其是扩增模板的拷贝数较低时，PCR扩增产物往往会产生许多非特异条带，影响研究人员对结果的判断。对于包含较多非特异条带的PCR产物分析，作者推荐使用southblot杂交的方式进行。其次，在作者发表这两对引物时，仅有9种类型的HPV病毒序列得到测定，现在已知的多数HPV病毒类型的序列仍然处于未知状态。因此，作者设计GP5/6和GP11/12时可用的HPV病毒序列信息是有限的，不可避免存在较大的改进空间。虽然具有局限性，但这两对通用引物尤其是GP5/6及其衍生物仍然是十分成功的，因为它较早的实现了高通量HPV病毒检测[27]。图2：GP5+/6+引物序列及其与23型HPV病毒的匹配情况小点表示各型HPV序列与引物序列相同，各型HPV序列与引物序列的差异用相应碱基字母标出对通用引物GP5/6的序列分析，发现HPV病毒序列的引物结合区域向3′端延伸仍然存在数个碱基的保守序列。据此，Ana-MariadeRodaHusman等通过对GP5/6通用引物的改进发展了新的通用引物，称为GP5+/6+[28]。由于引物结合区域配对碱基序列比GP5/6多，GP5+/6+具有相对较高的特异度和敏感度。在对22例克隆的HPV病毒序列扩增实验中，GP5+/6+的敏感度比GP5/6高10到100倍。并且在对PCR产物的电泳分析发现，GP5+/6+产物的特异度好，杂带少。GP5+/6+通用引物的检测敏感性仍然与引物结合区域的碱基匹配程度相关。当GP5+/6+引物与模板匹配较好时，可以检测到飞克（femtogram）水平的病毒序列，而当其中一个引物或引物对与模板存在4个或更多碱基错配时，只可以检测到皮克（picogram）水平。将GP5引物向3′端延伸三个碱基，有TAC或CAC两种选择（如图2所示）。研究发现，当选择CAC序列时，引物内部容易形成六个碱基的互补结构，这样的结构会促使引物二聚体的形成，反而使检测敏感性下降。选择TAC序列则不会出现此情况。与此相同，GP6引物向3′端延申有两种选择（5'TACTC3'或5'TATTC3'），根据同样原因而选择了5'TACTC3'序列。虽然GP6+引物的3′端仍然存在3个碱基的保守序列，但研究者并没有继续向外延伸，因为那样将会使两条引物的Tm值相差过大。并且，引物过长，必然需要提高PCR反应的煺火温度，这也不利于与引物存在较多剪辑错配的HPV型的检测。虽然比起GP5/6来说，GP5+/6+引物在多数HPV型中都引入了一个或更多的碱基错配，但是这对引物总体上提高了引物与模板的结合能力，使用这对引物进行PCR反应可以获得更好的特异性和敏感性。研究人员对GP引物的改进，并没有局限在序列的优化方面。MarkFEvans等发展了递减PCR（TouchdownPCR）的方法来获得更敏感及更特异的PCR扩增[29]。递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm5℃。因此，在反应的前几个循环，特异性最高的目的片段会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。这样就允许后续循环中使用较低的煺火温度而不至于影响反应的特异性。递减PCR可以很好的扩增模板很少的样本以及与通用引物序列结合区域存在较多错配的HPV类型。在作者发表的论文中，使用TouchdownPCR检测宫颈癌样本比经典的GP5+/6+PCR条件发现了更高的阳性率和更多的感染型别。另外，经典的GP5+/6+PCR条件检测26例乳腺癌样本的阳性率为19％，而使用TouchdownPCR检测的阳性率为58％。通过对宫颈脱落细胞样本检测研究表明，使用GP5+/6+进行PCR后，产物凝胶电泳分析时的敏感性比GP5/6提高11％。如果使用混合探针对PCR产物进行杂交分析，敏感性提高4％。但是，在GP5+/6+阳性而GP5/6阴性的样本中，不包括六种在宫颈中常见的HPV类型。这是因为这些HPV型的引物区序列本生就与引物匹配性很好，引物的修改没有显著的增加其扩增效率。GP5+/6+虽然具有较高的扩增效率，也仍然存在一些缺陷，如对HPV52一种常见的宫颈高危HPV扩增效率不高[30]。但作为一种成功的通用引物，GP5+/6+对于大规模人群筛查，及多种类型HPV感染，HPV多重感染样本的检测具有意义[31]。图3：GP5+/6+的普通PCR条件和TouchdownPCR反应条件比较2、MY09/11/HMB01及PGMY09/11通用引物图4：MY09/11/HMB01引物序列及其与18型HPV病毒的匹配情况小点表示各型HPV序列与引物序列相同，各型HPV序列与引物序列的差异用相应碱基字母标出简并碱基表示如下：M＝A或C,W＝A或T,Y＝C或T,R＝A或GMY09/MY11由Manos等于1990年最早发表[24]。当时，仅有HPV6、11、16、18、33五种病毒序列被研究人员完全掌握。所以基于这五种HPV病毒序列，人们选择了L1基因的一段保守序列设计通用引物，并希望该引物可以通过一次PCR过程同时扩增出这五型HPV病毒。为了推广应用该引物，研究人员假定其他序列没有完全知道的HPV病毒基因序列在这一段也是保守的，同样适用于该引物扩增。事实上，MY09/MY11引物只与HPV6型的引物结合区域序列完全匹配，其它几型都存在在一些碱基位点的序列差异。为了使引物能够更好的与存在序列差异的结合区煺火，该引物的设计者采用了简并碱基的方式。因此，MY09/MY11是由24条序列存在差异的不同引物混合而成的。事实证明，MY09/MY11是十分成功的通用引物[32][33]。