核酸探针技术及应用

核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。一、核酸探针技术的原理DNA或RNA片段能识别特定序列基因的DNA片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。核酸探针技术是将双链DNA经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA(或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA或RNA杂交。二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。探针亦可用3H标记，最后用液闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等标记，最后用酶标法显色，均能得到满意效果。1核酸探针的制备核酸探针可分为DNA探针、CDNA探针、RNA探针和寡糖核苷酸探针，因其种类不同制备方法也不同。1．1DNA探针DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简单，只要将染色体DNA分离纯化，然后进行标记即可。基因片段探针则需要将染色体DNA用限制性内切酶酶解，得到许多随机片段，然后与质粒重组，转化大肠杆菌(E·coli)，筛选含特异目的基因片段的克隆株进行扩增，再提取基因片段作探针。1．2CDNA探针通过提取纯度较高的相应mRNA或正链RNA病毒的RNA，反转录成CDNA作为探针。也可以进一步克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖，再从重组质粒中提取CDNA作探针。1．3RNA探针有些双链RNA病毒的基因组在标记后，可直接用作探针。另一种是从CDNA衍生而来的RNA探针，可由很强的RNA聚合酶转录而得。其优点为CDNA探针所不及，由于RNA—RNA复合物比DNA—RNA复合物稳定，所以其灵敏度可提高10倍以上。1．4寡核苷酸探针用DNA合成仪可以合成50个核苷酸以内的任意序列的寡核苷酸片段，以此作为核苷酸探针，也可将它克隆到M13系统中使之释放含探针序列的单链DNA，使探针的制备和标记简化。2核酸探针的标记核酸探针过去采用放射性同位素进行标记，常用标记物有α32PdNTP，35SdNTP等。同位素的选择是依检测类型而定，制就的DNA探针先经加热变性成单链后再与固定于硝酸纤维素膜上的待测DNA杂交，如为同源则与之结合，经放射自显髟后，膜上出现黑色区。放射性同位素标记的优点是敏感度高，对被检样品处理要求不高，假阳性率小，且32P代替磷原予不改变碱基空间结构，所以不影响杂交反应的动力学曲线。其缺点是半衰期短，费用昂贵，同时需防护设备，另外放射自显影时问较长。因此近年来发展了非放射性标记，用于标记的非放射性物质有金属(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。和酶等，应用较多的是生物素。非放射性标记的特点是保存时问长，检测时使用方便，其最大缺点是灵敏度一般比放射性同位素低，但最近报道用化学发光物吖啶酯直接标记DNA探针，用化学发光仪检测杂交体，其灵敏度超过放射性同位素标记的探针。可以予料化学发光物标记技术和均相杂交技术相结合可能是未来核酸探针分析技术的发展方向。在这里介绍一种非放射性标记“生物素核酸探针”，其基本原理为：生物素(Biotin)是一种B族维生素，能与抗生素蛋白——亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)特异性结合，其解离平衡常数(KD)为10-5。每个生物素分子由四个相同亚基组成，每个亚基都能专一性地识别一个生物素分子的脲基环部分。当生物素的戊酸侧链通过酰胺键与其他分子相连后，其脲基环保持与亲和素之一结合的能力，因而可通过生物素的戊酸侧链与待测目标相连。利用生物素和亲和素专一结合的特点，加入与荧光物质或酶相偶联的亲和素，去寻找被生物素所标记的目标，然后检测荧光或酶反应而检待测目标。3标本处理首先从标本中提取DNA作为靶源后方能用探针进行检测。提取DNA可用DNA提取仪，它是用一支包装的小柱于30分钟内快速提取DNA的仪器。标本经快速过柱后，达到纯化，DNA加热变性使成单链(RNA是单链勿需予先变性)采取标本可能是未知病原体悬液，亦可能是痰或粪便标本等。目前已发展了不需抽提核酸而直接在细胞裂解液中进行检测的方法。用高浓度的硫氰酸胍直接使细胞裂解，并使细胞内所有蛋白质包括核酸酶变性，释放出核酸，使缠绕的DNA分子解缠绕，形成一个适宜直接杂交的液相环境，这样的标本处理方法不仅减少了工作量，而且容易掌握，国外在爱滋病的病毒检测中已应用这种方法对血细胞进行处理。样品处理要考虑的另一个问题是待测样品中目的序列的含量或总的核酸量。如果古量太低必然会影响检测的灵敏度。解决的办法是用聚合酶链式反应(PCR)的方法，它能在体外通过DNA聚合酶将目的序列的拷贝数特异地快速扩增1O5～107倍，使标本中目的序列的含量大为提高，便于检测。目前PVCR法已广泛应用于DNA诊断的各种技术中，在遗传病的产前诊断，传染病的早期诊断和法医物证鉴定中均取得了满意的结果。4核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidbybridization)是指标记的单核苷酸和所需检测的目的单链核酸通过碱基配对互相结合的过程。若为双链核酸则事先需要变性，使之打开成单链。杂交程序的发展经历了由固相到液相再到均相杂交的过程。程序越来越简单，检测周期越来越短，同时提高了检测的灵敏性和准确性。液相杂交不需要固相杂交那样经过电泳分离和固定待测序列，而是在溶液中探针与目的序列杂交再通过固相捕获分离杂交体进行检测。均相杂交是直接将目的序列和探针在溶液中进行杂交和检测．由于不需从溶液中分离出杂交体，因而使检测周期大为缩短，是目前最简单的杂交程序。4．1固相杂交固相杂交是将欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应。杂交结果可通过酶促化显色法直接显示或用仪器检测或进行放自显影。从目前杂交技术的发展情况看，固相杂交技术发展较迅速，而且应用范围更加广泛。常用固相杂交技术有以下几种。4.1.1印记杂交此法包括了DNA转移杂交法(Southern印迹法)和RNA转移杂交(Northern印迹法)。（1）DNA转移杂交法(Southern印迹法)先分离DNA，经或不经核酸内切酶的切割，用琼脂搪电泳法(凝胶电泳分离)使DNA按分子量大小移动分开，然后使凝胶中的DNA转移至硝酸纤维索膜上，再以31P标记的DNA探针进行杂交。此法不仅敏感特异而且可通过放射自显影直接观察血清或组织中病毒DNA桉酸片段分子量的大小。（2）RNA转移杂交(Northern印迹法)是分析RNA(主要是mRNA)的分子杂交技术。其原理是与DNA转移杂交相似，不同的是RNA转移杂交是在变性剂存在下进行凝胶电泳分离RNA或mRNA，变性剂是防止RNA分子二级结构发生卡环的形成，保持其单链线型状态。电泳分离后，将凝胶上RNA带转移至硝酸纤维素膜上，再以探针与之杂交。4.1.2膜杂交法通过狭缝印迹(Slotblot)、Soutbernblot、Northemblot或转种点膜法固定到膜上的DNA杂交方法基本一致，先用不含探针的杂交液作预杂交，用载体DNA和合成聚合物将膜上非特异DNA结合位点封闭住，再换上带有标记探针的杂交液进行杂交，使探针与被检核酸结合。根据探针要求，采用不同漂洗条件可先洗去未杂交探针。4.1.3细胞内原位杂交法(原位分子杂交法)用同位素或非同位素标记的探针对感染细胞或包埋组织中的病毒核酸变性后进行杂交，然后用放射自显影或酶催化显色法或免疫荧光法进行检测。使用同位素标记核酸探针作细胞原位杂交，其灵敏度高，而生物素标记核酸探针用免疫荧光法或铁蛋白一抗生素蛋白作检测系统，可直接在显微镜下观察结果，它不仅可用于细胞学和组织学研究，还可用于其他方面。4.1.4斑点分子杂交法将已经加热或碱处理变性的待测DNA直接滴于硝酸纤维素滤膜上，(或将其直接点在滤膜上再加热或碱处理变性)用32P或125I标记的已知DNA探针与之杂交，滤膜上出现同位素斑点者，经放射自显影可直接观察。此法简便、快速，已广泛应用于检测各种病毒核酸。4.1.5夹心杂交将已知基因分为二部分，一部分基因作片段不标记，固定在膜并使之与未知标本中的基因杂交，然后经过清洗去除杂质，再用已知基因的一部分经标记后，与之进行杂交。这样可有效地排除杂质干扰，提高探针检测的特异性。4.2液相杂交液相杂交是指待检测的核苷酸样品和核酸探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交的双链和未参加反应的单链核酸包括未结合的探针。用仪器检测并通过计算分析杂交结果。液相杂交速度快，但它的缺点是不易分离游离和杂交的探针，给常规应用带来困难。三、核酸探针技术在实际中的应用状况核酸探针技术主要用于检测临床标本中的病原微生物，以诊断病毒、细菌等疾病。另外在检测抗生素的耐药性、流行病学调查、恶性肿瘤、遗传病、法医学鉴定、食品卫生及兽医等方面也已应用。1在病原微生物的检测方面在许多病原微生物的检测上，常用的分离培养方法需要的时间较长，手续也较繁杂，而且病灶和粪便等病料含杂菌较多，妨碍病原微生物的检出，不能快速作出诊断。免疫学方法也有许多不足之处，尤其在持续性感染和感染潜伏期抗体尚未产生或不易检测出抗体的情况下，即使有抗体存在也难以判断。而应用核酸探针技术，就可以直接确定受感染组织中是否存在病原微生物的特定核苷酸，在短时间内获得诊断结果。因此，核酸探针技术不仅能够应用于急性传染病，也可用于慢性传染病和传染病早期诊断。另一方面核酸探针不象抗原，多克隆抗体或单克隆抗体那样会出现一批产品与另一批产品不一致情况，制备核酸探针的DNA片段相当稳定，可长期保存，较之常规微生物学诊断方法具有许多优点。因而受到国内外的重视。目前，EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等50多种病毒的核酸探针以及致病性大肠杆菌、志贺氏菌、军团菌、结核分枝杆菌和非典型分枝杆菌等细菌的核酸探针已开始应用于检测。在兽医上牛白血病、传染性牛气管炎病毒、疱疹病毒、牛羊蓝舌病病毒、绵羊的梅迪／维斯纳病毒、猪伪狂犬病毒、禽败血支原体和滑膜支原体等动物病原微生物的核酸探针也开始用于临床。2在遗传性疾病及点突变的直接分析方面DNA分子中某个碱基的替换或核苷酸的插入缺失及重排都可能引起遗传性疾病。一般可以根据遗传性基因产物的改变来分析遗传疾病的发生，但对那些不能用蛋白产物进行分析的遗传疾病可用DNA杂交技术进行分析。对于那些基因点突变引起的限制性内切酶作用部位增加或消失、或因DNA顺序的增加、缺失或重排、使各位点之间的DNA长度发生改变而引起的遗传疾病可用DNA探针直接分析。用DNA杂交技术已直接分析了动脉粥样硬化、糖尿病和生长激素缺陷等遗传病。目前化学合成的核苷