选修一--生物技术实践知识复习汇总

1选修1《生物技术实践》知识归纳图解(马中邹伟春)（一）培养基的基本知识1．培养基的营养成分营养物质定义作用主要来源及所涉及的微生物碳源凡是能提供微生物所需碳元素的物质构成生物细胞、生物体及细胞代谢产物，有些能为异养生物提供能源无机化合物：C02、NaHC03等-----------------自养生物有机化合物：糖类、脂质、花生粉饼、石油等--异养生物氮源凡是能提供微生物所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物，也可为异养微生物提供能源无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐-----自养生物有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等---异养生物水分生物体内含量最高的组成成分，分为结合水和自由水良好的溶剂、细胞生活及生化反应的介质、参与物质运输及参与生化反应的反应物培养基、大气、代谢产物无机盐为微生物提供大量除C、H、0以外的各种元素细胞组成成分，生命调节物质，自养菌的能源或其他营养来源，酶的激活剂培养基、大气等环境生长因子微生物正常生长繁殖，必不可少的微量有机物可作为酶与核酸等的组成成分维生素、氨基酸、碱基等高考警示钟自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同(1)自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。(2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。2．培养基的配制原则(1)目的明确。要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。(2)营养要协调。各种营养物质要保证适当的浓度和比例。营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。营养物质的浓度比(如C/N)还会直接影响某些微生物的代谢产物，如谷氨酸生产，C/N=4∶1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产量少；而C/N=3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。(3)pH要适当。不同微生物生长所需pH不同。如细菌pH保持在6.5～7.5之间；放线菌保持在7.5～8.5之间；真菌应保持在5.0～6.0之间。3．培养基的分类及作用：培养基种类很多，作用也不同。根据不同的分类标准，可将培养基分为不同种类。划分标准培养基种类特点用途及实例物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如：琼脂观察微生物的运动、分类鉴定、保藏菌种固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如：培养酵母茵或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养以尿素为氮源的微生物用尿素固体培养基)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物（如用伊红一美蓝培养基鉴别大肠杆菌，茵落呈深紫色，并有金属光泽。用酚红鉴别有脲酶的细菌，菌落周围有红色环带)微生物的实验室培养2说明：①病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。②加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。③选择培养基一般只生长具有特定的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。注意：选择培养基的选择方法(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。（二）灭菌技术1．无菌技术的概念在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的。2．消毒、灭菌的方法项目概念常用方法应用范围消毒使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min一些不耐高温的物体如牛奶煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6min一般物品化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、漂白粉、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖可用来对环境、双手和衣物等消毒紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min接种室灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法：酒精灯火焰接种工具如接种环、接种针等干热灭菌法：在160～170℃加热1～2h如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具高压蒸汽灭菌：压力为100kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30min培养基及容器、无菌水等的灭菌注意：①无菌操作是微生物培养过程中，防止杂茵污染的关键步骤。②消毒只能消灭或抑制营养体的活动，而不能达到彻底灭菌。酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，因浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中；浓度过低，杀菌力减弱。而灭菌除杀死营养体外，还必须杀死芽孢和孢子。③灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。3（三）微生物的纯化培养技术1．常用细菌培养基——蛋白胨培养基配制流程：2．纯化大肠杆菌Ⅰ．原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。Ⅱ．微生物接种方法：(1)平板划线法：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。(如图)(2)稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；(第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者)（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾不能相连；（3）操作始终在酒精灯火焰旁进行。涂布操作时注意：计算称量溶化灭菌注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量注意：①倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。②平板冷凝后要将平板倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长，也可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基，影响pH；其次防止细菌透过皿底、皿盖的缝隙，落在培养基上。③倒平板时，不能将培养基溅在皿底与皿盖之间，以防止杂菌滋生，污染培养基（调PH）倒平板注意：①牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量②牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速注意：①溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度注意：由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH装瓶注意：分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5注意：①可用高压蒸汽灭菌法②用干热灭菌法时温度160～170℃(不能超过180℃，否则易引起报纸等燃烧)③一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板,再灭菌4（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。3．菌种的保存①对于频繁使用的菌种，可以采用4℃冰箱中临时保藏的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用-20℃甘油管藏的方法。注意：①菌种保藏的原理是：低温、干燥和隔绝空气，使微生物代谢能力和繁殖能力降低。②不同菌种的保藏方法因不同菌种而异。需氧型，必须低温有氧，而厌氧型必须低温无氧；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培养基，而寄生微生物需提供活体组织等非人工培养基，如病毒需提供活鸡胚。（三）微生物的筛选与计数（以“土壤中分解尿素的细菌”为例）筛选菌株原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长培养基的成分：尿素作为惟一的氮源(选择培养基、固体培养基)菌落计数菌种的鉴定对照：将不接种的培养基置于相同温度恒温箱培养(目的:证实培养基是否被杂菌污染)统计茵落数目的方法：(1)显微镜直接计数法①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物数量②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。方法：检测培养基pH的变化判断原理：在细菌分解尿素时，分泌的脲酶将尿素分解为氨，氨使培养基碱性增高，pH升高，使酚红呈红色（红色环带）5更多的水果成分溶解和分散在果汁中一、思路：水果果汁（出汁率高、澄清度高）（果胶）果胶酶、果胶甲酯酶（来自黑曲霉、苹果青酶）（半乳糖醛酸）二、探究制作果汁的最佳条件(1)实验原理：果胶酶能将果胶水解成半乳糖醛酸，提高出汁率和澄清度；果胶酶活性受温度（PH）影响，处于最适温度（PH）时，活性最高；低于或高于最适温度（PH），酶活性受到抑制，即果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比；果肉的出汁率、果汁的澄清度（果胶不溶于乙醇，果汁中加95%可检测澄清度即果胶水解的程度）反应了果胶酶的活性。(2)设计思路：设置一系列梯度温度（PH），从中选出酶活性最高的温度，然后再以该温度（PH）为中心，缩小温度（PH）梯度向两个方面各设置梯度温度（PH），以进一步确定最适温度（PH）范围。所选择的温度（PH）只能接近最适温度（PH），但不一定就是最适温度（PH）。(3)实验操作流程及注意事项注意：①每个探究实验的设计，都要遵循实验设计的一般原则，特别是单因子变量控制原则。②如果随酶浓度增加，果汁体积也增大，说明酶用量不足；当酶用量达一定值时，再增加酶用量，果汁体积不变，则说明这个值就是酶的最适用量。果汁中的果胶和果胶酶制备水果泥注意：苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水100～200mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥制备果胶酶水果泥、果胶酶分别水浴保温（水果泥、果胶酶混合水浴保温记录果汁量自变量：温度(应控制为唯一)对照：相互对照无关变量：果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的pH等所有其他条件(应控制为相同)设计实验方案确定温度（PH）梯度→探讨控制温度（PH）的方法和措施确定水果的种类→确定制备果汁的方法→确定实验用的水果量→确定果胶酶的量→探讨测定果胶酶活性的方法动手实验过滤出果汁改变不同温度后重复上面实验(也可同时进行不同温度的实验)记录实验数据得出结论记录表格设计温度/℃102030405060果汁量/mL原因：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问