发育生物学-附肢的发育与再生

附肢的发育与再生附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样的诱导作用。幼虫期两栖类的附肢损伤后能够再生，研究再生也很重要。有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再生能力，是研究再生的极好模型。脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官，具有许多不对称的部分。脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层和外部的表皮共同形成的，但最后的形式各不相同。如前肢可形成前足，上肢，翅，鳍等。一、起源第一节脊椎动物附肢的发育鸡翅内骨的排列模式及其不对称性附肢的骨头主要包含3个部分：靠近体壁的肱骨humerus，在中部的一个桡骨radius和一个尺骨ulna以及掌骨metacarpal，和最远端的指骨digit组成。附肢在3个基本轴上是不对称的，但左前肢总是和右前肢呈镜面对称。脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的，主要是由来自侧板中胚层的体节部分和体节腹侧部产生的疏松间质形成的中央核，以及位于外部的，来自外胚层的表皮两大部分组成。附肢的基本成分（骨骼，肌肉和结缔组织）是由中胚层形成的，许多实验证明脊椎动物胚胎中的预定附肢区已被定位。能形成一个附肢的所有细胞，称为附肢域（limbfield），包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞以及形成周围躯干组织和肩带的细胞,这两个区域称为附肢盘(limbdisc)。美西螈（Ambystomamaculatum）的预定前肢域腮周侧翼组织附肢肩带体节前肾腮020406080100120一月二月三月四月亚洲区欧洲区北美区二、附肢的早期发育（一）外胚层和中胚层间的相互作用（二）轴的建立（三）同源基因的作用两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解轴上生肌节芽生肌节生骨节脊髓脊索前肾内胚层生皮节轴下生肌节芽附肢芽肌肉前体附肢芽骨骼前体侧板中胚层附肢芽覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增厚并向外突出。这个含有覆盖在外面的增厚上皮和被包在内部的间质细胞团突出物增大并变为附肢芽（limbbud）。附肢芽在顶端通过未分化间质细胞的持续增殖而伸长。这个增殖区域是一个大约250微米厚的和由未分化的细胞组成。在附肢伸展期间，更近体侧的那些顶端细胞显示出减弱的有丝分裂能力，它们开始聚集在附肢中心，形成软骨性成分，最后产生附肢的骨骼。骨骼成分的分化是以近远的方向进行：鸡翅中第一个出现的软骨是肱骨，然后是桡骨和尺骨，最后是掌骨和指骨。同时，预定肌细胞前体聚集在软骨周围形成肌肉群体。早期附肢芽的诱导作用主要是由Wnt蛋白质和成纤维生长因子FGF10引起的。在附肢形成早期，附肢芽形成的信号来自侧板中胚层细胞，它们将来变为预定附肢的间质。这些细胞分泌FGF10，而FGF10能够促使外胚层和中胚层之间分肢形成的交互作用。FGF10刚产生时遍布侧板中胚层，但在附肢芽形成前集中在侧板中胚层将形成附肢的区域。这些集中的地方是由于Wnt蛋白的作用，Wnt蛋白稳定FGF10在这些位点的表达。A.FGF表达首先发现于整个侧板中胚层，后来被Wnt8c稳定在后肢形成的区域。B.FGF10的合成是被Wnt2b稳定在将来前肢形成的区域。C.这两个侧板中胚层区的FGF10在顶外胚层嵴（AER）中诱导Wnt8。这个诱导作用是通过在反应组织外胚层中Wnt3a途径完成的。由AER分泌的FGF8诱导中胚层继续表达FGF10。孵化48－54h鸡胚附肢芽开始形成的分子模型侧板中胚层表皮外胚层体节中胚层中间中胚层研究表明：编码转录因子TBX4和TBX5分别与后肢和前肢的特化有关。实验表明：TBX4和TBX5基因分别在小鼠的后肢和前肢表达，说明TBX4和TBX5分别特化后肢和前肢。附肢芽发育为前肢还是后肢？1.将分泌FGF的念珠菌植入鸡胚前，后肢芽之间可诱导异位的附肢，产生附肢的类型取决于TBX蛋白质的表达。2.将念珠菌植入靠近后肢TBX4表达的部位将诱导后肢。3.将念珠菌植入靠近前肢TBX5表达的部位将诱导前肢。TBX4和TBX5在肢型特化中的作用Tbx5(蓝色)表现于前端的侧板中胚层，此部分的肢芽将形成翅膀；Tbx4(红色)表现于后端的侧板中胚层，此部分的肢芽则形成腿。若将含有FGF的念珠菌植入表现Tbx4和Tbx5之间的区域，则在此区域前端诱发Tbx5表现，于后端诱发Tbx4表现，所以此区域的分肢将同时形成翅膀和腿的构造。在鸟类和哺乳类中胚层诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚的特殊结构，称为顶外胚层嵴（AER)。AER发现于大多数较高等的脊椎动物中，包括哺乳动物，但不存在于有尾两栖类。AER对附肢继续向外生长是至关重要的，但它只是一个临时结构，在鸡胚中，当第八天就消失了。顶外胚层嵴apicalectodermalridge(AER)扫描电镜观察孵化4.5天的鸡胚肢芽，显示顶外胚层嵴AER。（一）外胚层和中胚层间的相互作用附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的相互作用。一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。前肢中胚层除去AER额外的AER腿中胚层非附肢中胚层附肢发育停止翅腿AER退化附肢发育停止顶外胚层嵴AER通过位于下方的中胚层诱导作用的总括说明AER是维持间质细胞分裂，推动肢体向外生长所必须的说明AER影响A-P轴线说明间质细胞决定了肢体的类型说明间质细胞是维持AER所必须的渐进带(PZ)在附肢发育中的作用渐进带(progresszone)位于肢芽的顶端，由快速分裂和增殖的未分化细胞组成。顶外胚层嵴AER位于渐进带的上表面。不同时期的渐进带细胞的移植对附肢发育有着不同的影响(见下图)AER对下方的渐进带发出信号，如将AER移植到早期肢芽的背部将诱导异位生长。渐进带（PZ）细胞控制近－远端分化A.将早期翅芽的PZ移植到已经形成尺骨和挠骨的晚期翅芽中，形成额外的尺骨和挠骨。B.将晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中间结构缺失。中胚层在附肢发育中起着关键作用。AER起初的形成和继续存在依赖位于其下方的中胚层。如果将预定附肢中胚层移植到躯干部外胚层下面，将形成一个AER和发育出一个额外的附肢。如果将早期鸡胚附肢芽中胚层切除，然后将剩余的外胚层包裹非附肢的中胚层，则AER退化，中胚层停止增殖。发育附肢的结构是受中胚层指令的诱导作用决定的。特例:有尾两栖类不同。附肢发育的潜能被证明存在于从前肢到后肢的整个躯干部。通过移植一个耳泡或鼻原基到前肢和后肢的区域，可在那里诱导出额外的附肢，如下图。这种移植物作为一种“异常的诱导者”激活了躯干部组织中潜在的能力。从以上结果看出，附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER第二，AER刺激附肢芽中胚层的进一步增殖及向外生长和分化第三，附肢芽中胚层提供保持AER所必须的刺激（二）轴的建立脊椎动物完全形成的附肢包括三个轴的发育，分别是近－远（P-D)轴、背－腹(D-V)轴和前－后(A-P)轴。附肢发育中三个轴的建立具有各自的时间性，其顺序可能是：A-P轴－D-V轴－P-D轴。（1）近-远轴（P-D）的发育附肢沿近远轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。附肢芽的逐渐向外生长是由于位于AER下面渐进带的间质细胞的增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGF-2可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。AER对于肢芽近-远轴的发育是必须的。从正在发育的肢芽中去除AER，将导致肢芽生长的停止；在发育后期将AER去除，可得到较为完整的肢。生长因子可以替代顶外胚层嵴。将AER切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。附肢沿P/D轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。渐进带(PZ)的间质细胞在其中起到重要作用。但是这些间质细胞如何特化近-远轴？有两个模式被提出来解释这个现象：①渐进带模式（progresszonemodel）重视“时间”的量度②早期定位与扩散模式（earlyallocationandprogenitorexpansionmodel）重视“空间”的量度假设在附肢内中胚层细胞的命运是由它们在附肢顶端被称为渐进带(progresszone;PZ)的区域中保留多长时间决定的。一个细胞在增长区所花的时间越长，它获得越多有丝分裂的机会，而其构造越往远程发展。既然增长区要维持一定的大小，当肢干生长时，细胞必须不断离开增长区；一旦细胞离开，他们就形成软骨组织。所以，第一个离开的细胞会形成附肢最近端的成分(如肱骨)，而最后离开的细胞形成附肢较远端的成分(如指骨)，见下图A渐进带模式（progresszonemodel）认为肢芽在很早就已经分化了，后来的细胞分裂只是扩张已经分化的区域，见下图(B)。当早期将AER移除的时候，这些特化的区域还没扩张，所以大部分的间质细胞(在AER200μm之内)都死亡了，但当在较后期的胚胎阶段，肢芽生长且区域扩张了，200μm的范围只会删除掌骨和指骨的部分。早期定位与扩散模式Earlyallocationandprogenitorexpansionmodel间质细胞特化近-远轴的两种模式研究发现,Hoxa和Hoxd复合物的5ʹ部分好像在小鼠前肢芽中起作用。根据这些基因的表达模式和自然发生的及敲除基因形成突变体的情况，Davis等假设一种模型：hox基因特化确定附肢的一个特定区域,如下图。hox基因产物在特化附肢发生地点中的作用hox基因将在特化特定间质细胞变为附肢的近端和远端部分起作用。假设5ʹhox旁基因特化前肢的特定区域Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟桡骨，Hox-12特化掌骨，Hox-13特化指骨。5ʹhox旁基因肩胛骨肱骨尺骨和桡骨掌骨指骨图(A)为正常老鼠的前肢，而图(B)为敲除所有hox-11基因和hox-11旁基因的四个位点，产生的小鼠前肢缺少尺骨和桡骨。A.在肢柱形成(Ⅰ期)期间，Hoxd-9与Hoxd-10在新形成的附肢芽中表达。B.在肢杆形成(Ⅱ期)期间，hox基因呈鸟巢状表达，Hoxd-9到Hoxd-13在附肢芽后部表达，但只有Hox-9在附肢芽前后两部分表达。C.在肢身形成（III期）时，Hox基因的表达逆转，Hoxd-13和Hoxa-13在附肢芽前后两部分都表达，而Hoxd-10到Hoxd-12以及Hoxa-12仅在后部表达。在四肢动物附肢发育期间HOX基因表达的变化I期肢柱II期肢杆III期肢身肱骨桡骨尺骨掌骨和指骨（2）背-腹轴（D-V）的分化背-腹轴与来自中胚层和外胚层两者的细胞特化相关背-腹轴分化可能是由肢芽背部外胚层的特异性旁分泌因子(Wnt7a)诱导产生的。背部中胚层同时诱导背部肢芽的rFng和Wnt7a分子表达。腹部中胚层诱导engrailed-1（en-1）在肢芽腹部表达。Wnt-7a在背部外胚层中表达，它诱导背部中胚层的Lmx-1表达并特化背部轴向形成。rFng同样也在背部外胚层中表达。en-1表达细胞和rFng表达细胞之间的相互抑制作用，将决定顶外胚层嵴AER的中部边缘位置。En-1表达细胞与Wnt-7a相互抑制，由此对肢芽腹部区域进行定位.外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。Wnt-7a在背部外胚层中表达，而Engrailed基因在腹部外胚层中表达。lmx-1基因在背中胚层中被Wnt-7a诱导表达，并且参与背部结构的确定在鸡胚发育附肢芽的前-后轴极性是在肢芽能识别之前就已特化。前后轴是由年幼肢芽和体壁后部连接处的一小团中胚层细胞特化的，中胚层的这个区域被称为极化活动区（zoneofpolarizingactivity，ZPA）。当ZPA被移植到另一肢芽前侧位置时，形成的翅指数目加倍，额外一组指的结构与正常发育指的结构呈镜面对称，如下图。（3）前-后轴（A-P）轴的特化当极化活性区(thezoneofpolarizingactivity;ZPA)被移植到前端肢芽的中胚层时，一模一样的