疟疾血检技术培训

全球基金疟疾项目镜检技术培训（二）户县疾病预防控制中心2012年3月28日疟原虫检验技术采集血样血片制作血片染色疟原虫镜检采集血样采血部位：耳垂或无名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小,薄血膜血量为厚血膜的一半或1/3。厚血膜：用推片的一角，取血一小滴（约4－4.5微升），置于平置的载玻片上，由里向外一个方向旋转，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。薄血膜：以推片一端的中部取血一小滴，使血滴与载玻片接触，血液沿推片边缘向两侧展开，将推片与载玻片保持300-450，均匀而迅速适当地用力向前推成舌形薄血膜。血片制作（一）厚血膜薄血膜血片制作（二）标准的疟疾厚薄血膜片：把载玻片分成六等份，把厚血膜涂在从右到左的第三格中央，薄血膜涂在第四格前缘至第六格中部，第一、二格备贴标签编号用。厚、薄血膜间用蜡笔划线分开厚血膜血量不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列血片制作（三）不同血片涂布法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片血片染色（一）染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法WHO推荐使用吉氏染色法血片染色（二）吉氏原液的配制：吉氏染粉(AzureBtype)１g甘油(纯)50ml甲醇(纯)50ml把吉氏粉置于研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直至50ml甘油完全加入，倒入棕色瓶中。然后在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，洗液倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，充分摇匀，置于65℃温箱中24小时，或室温阴暗处1-2周后过滤，备用。整个染色液配制时间不能少于5个小时时间越长染色效果越好。血片染色（三）吉氏染液的配制：把吉氏原液用PH7.0±0.2缓冲液稀释，比例约为1:15～20，稀释后方可用于厚薄血片染色。吸取原液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.血片染色（四）血膜固定：血膜充分晾干后，用甲醇固定薄血膜。厚血膜上滴加蒸馏水进行溶血，到血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干后再用甲醇固定。注意：①薄血膜固定时，甲醇不可触碰未溶血的厚血膜。②厚血膜溶血时，蒸馏水不可触碰薄血膜。血片染色（五）血片染色：1.吉氏染色法：把吉氏染液滴加于已固定的厚、薄血膜上，室温染色30分钟，用缓冲液冲洗干净。血片晾干后镜检。2.快速吉氏染色法：取吉氏原液1ml，加缓冲液5ml，混匀后，滴加于厚、薄血膜上染色5分钟，用缓冲液冲洗，晾干后镜检。血片染色（六）3.成批血片染色：将已固定的血片插入染色缸，加入吉氏染液浸没血片，对厚、薄血膜同时染色30分钟。注意：如果吉氏染液是从市场上购置的成品试剂，请严格按照说明书操作。血片染色（七）血片染色结果：染色质量好的血片：显微镜下核呈红色，胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列。如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏碱性吉氏染色血片外观血片染色（八）血片制作与染色注意事项：１、载玻片必须清洁无油污；２、固定薄血膜时，甲醇不要触碰到厚血膜；３、厚血膜在染色之前先用清水滴加在上面进行溶血，以防厚血膜染色后颜色发黑，影响镜检；４、血片充分干燥后方可染色，防止冲洗染液时厚血膜脱落。5、未染色血膜的放置时间夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定，影响镜检。疟原虫镜检（一）厚血膜薄血膜优点血量多，面积小，原虫较为集中。原虫检出率高血量少，面积大，干燥快红细胞完整，原虫形态极少变形。用于观察原虫形态与鉴别虫种。缺点原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较大，原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，但面积是厚血膜的8-10倍。检查费时，原虫检出率较低用途用于疟疾病人检查虫种、虫期鉴定及初学者教学标本疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点显微镜下厚血膜读片顺序疟原虫镜检（二）读片顺序：显微镜镜下按由上而下、之字形顺序读片疟原虫镜检（三）镜检疟原虫结果判断：阴性血片：①检查全部厚血膜视野未查见疟原虫；②最少检查100个厚血膜视野未查见疟原虫（临床病人）。阳性血片：检出各期疟原虫（环状体、裂殖体、配子体）。混合感染：在一个血膜上有2种以上疟原虫感染称为混合感染，较常见的是间日疟原虫与恶性疟原虫混合。镜检判断P.v+P.f混合感染：必须是看到P.v各期原虫和P.f的配子体。间日疟和恶性疟的鉴定要点疟原虫镜检（四）疟原虫镜检（五）疟原虫形态特征：间日疟（P.vivax）鉴定要点1.红细胞通常涨大2.薛氏点明显3.成熟环状体粗大4.滋养体胞浆有阿米巴样伪足5.血片中可见各期的原虫形态6.成熟裂殖体约含12-24个裂殖子疟原虫镜检（六）疟原虫形态特征：恶性疟（P.falciparum）鉴定要点：1.红细胞不涨大2.小滋养体（环状体）纤细,常有多重感染，环状体内可有2个核3.环状体可贴在红细胞边缘4.血片中没有其他发育期的大滋养体5.配子体呈新月形或腊肠形6.成熟裂殖体约含16-32个裂殖子7.可出现茂氏点镜检示教以下血片采自现症病例疟原虫镜检（七）间日疟环状体2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.间日疟滋养体3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.恶性疟雄配子体4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C三日疟裂殖体5.MalerecentlyreturnedtoAustraliaafterbackpackingthroughAsia.Historyofflulikesymptoms.白细胞6.NewAustralianpreviouslyfromMalaysia.Intermittenttemperaturesandheadaches.白细胞7.Achesandpains,withfever.?GlandularFever,?malaria.间日疟裂殖体恶性疟环状体18.RecenttriptoSouthernIndia-headachesandvaguelyunwell.间日疟裂殖体19.PatienthasbeenholidayingintheDominicanRepublic,nowfeverish.恶性疟雄配子体21.AmemberoftheUNforcesinEastTimor.Presentedwithhightemperature.恶性疟雌雄配子体间日疟裂殖体恶性疟雌配子体间日疟裂殖体血检质量考核实验室条件血检工作要求考核标准实验室条件人员：各单位至少有1名专职或兼职的经过疟原虫检验技术培训的人员。熟悉疟疾血片的制作，疟原虫的镜下特征，能承担疟疾血检工作。环境：实验室相对独立，可做疟疾血检。设备：显微镜、玻片、玻片架、玻片合、染色缸。试剂：吉氏染液、甲醇、二甲苯、镜油。血检工作要求制定《疟原虫镜检实验室管理制度》、《疟原虫镜检操作规程》对血检对象进行认真登记，填写《疟原虫镜检登记表》，按接样顺序编号。编号：医院名称代码＋序号。保留镜检过的所有血片，以备上级抽样复查，经上一级机构同意后方可清洗。阳性血片须专人管理。血液标本有潜在生物危害，在实验室血检工作、标本保存中应严格遵守《实验室生物安全通用要求》。县（市/区）全球基金疟疾项目发热病人疟原虫血检登记表血检单位：、序号姓名年龄性别居住地址外出史及地点职业发病日期体温（oC)临床初诊血检日期血检方法血检结果检验人签名血样编号镜检RDT阴性PfPvPmPo混合1234合计疟原虫血检考核标准(1)项目检查内容质量标准考核分值好分值中分值差分值血片制作厚血膜(25分）血量（5分）4～5цl5略多或略少3过多或过少1位置（5分）玻片右1/35稍偏右4偏右过多3直径（5分）0.8～1.0cm50.7～0.8或1.0～1.2cm30.7或1.2cm1外观(10分)圆形厚膜均匀,边缘整齐10圆形稍不均不整齐8厚薄不匀影响着色5薄血膜(25分）血量（5分）1～1.5цl5略多或略少3过多或过少1位置（5分）直径（5分）外观(10分）玻片1/2～1/3处5稍偏右或偏左4偏右或偏左过多32.5～2.0cm5稍大或稍小3过多或过少1舌状厚薄均匀10舌状稍不均5厚薄不匀呈波浪型3考核标准疟原虫血检考核标准（2）项目检查内容质量标准考核分值好分值中分值差分值血片染色质量(15分)外观（5分）蓝紫色5深蓝色3红色或灰白色2镜下(10分)白细胞、疟原虫胞浆蓝色，核红色10染色过深，原虫胞浆与核均呈深蓝色8染色过浅，胞浆蓝色不易显见，核淡红5血片清洁度(10分)外观（5分）光洁无油灰5稍有油污2油灰粘连2镜下（5分）无沉渣5稍有沉渣2沉渣多或有杂菌2疟原虫血检考核标准（3）项目检查内容使用标准扣分标准考核分值显微镜使用（25分）使用前（10分）显微镜干净，有绸布遮盖，接物镜不与聚光器对接显微镜稍有灰（-2分），无绸布遮盖（-4分），接物镜与聚光器对接（-4分）镜检时（10分）打开光源，调节亮度，聚光器上升至最高位置，油镜与聚光器对接，放入待检血片，镜台上升直至油镜与血膜接触，然后镜台徐徐下降，出现视野用微调调节聚光器未上升至最高位置即放血片（-2分），镜台上升或下降过快（-3分），压破玻片（-10分）使用后（5分）擦拭干净油镜，物镜转离聚光器，绸布遮盖未擦拭油镜（-1分），物镜未转离聚光器（-2分），未用绸布遮盖（-2分）合计100分