卵母细胞体外成熟的机制与临床应用

卵母细胞体外成熟的机制与临床应用主讲人：郑月慧南昌大学江西医学院2017年7月8日一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其发展现状二、卵母细胞体外成熟的机理及其调控三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估我将从以下三个方面陈诉：一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其发展现状卵母细胞的体外成熟技术(IVM)是一项辅助生殖技术，简单地讲就是，将卵巢小卵泡中的未成熟卵子取出，放在模拟体内卵泡微环境的培养液中进行体外培养到成熟阶段，排出第一极体，再进行体外授精技术帮助受精，体外受精过程与体内成熟的卵子大同小异。1、什么是卵母细胞的体外成熟技术？第一步：取出未成熟卵母细胞体外培养至成熟第三步：胚胎移植IVMTreatment第二步：体外受精一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其发展现状2、未成熟卵体外成熟技术的应用及其发展上世纪九十年代，试管婴儿之父——爱德华兹先生就把卵母细胞体外成熟技术（IVM），作为辅助生殖技术未来发展的三大前景技术之一，其它两个技术是微刺激和自然周期试管婴儿技术。近十余年来，IVM技术遍布全世界，对于一种不用或减少卵巢刺激，提高患者舒适度的治疗理念，人们一直在努力尝试更好的体外培养条件，以获得更高的成功率目前应用卵巢多囊综合征（PCOS）患者卵巢高度反应有卵巢过度刺激综合征（OHSS）病史卵巢不适于药物刺激而本身又没有成熟卵泡生长对自然周期IVF治疗同时取出其余小卵泡（IVF/IVM）一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其发展现状3、体外成熟技术安全吗？这同样也是我们医护人员们最为关心的问题。IVM出生的孩子遍布世界各地，目前全世界大概有5000～10000名体外成熟卵试管婴儿健康成长。其妊娠率可达到与体内成熟卵相当（35～50%）。结果表明，较其他辅助生殖技术，IVM技术并没有增加子代异常的风险但是，毕竟卵母细胞体外成熟技术，将使卵子暴露于体外条件更长时间，理论上增加了卵子受培养环境影响的风险，在基因编程、表观遗传学、伦理学等方面，还需要更加深入的研究和探索。因此目前该技术只是适用于特殊人群，还没有普及到每一例试管婴儿二、卵母细胞体外成熟的机理及其调控与自然状态下和传统的IVF等辅助生殖技术中卵母细胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母细胞的减数分裂在体外完成，该过程受如下多种因素影响：1、取卵方式与时间2、体外培养方法3、IVM实施方案卵母细胞体外成熟取卵方式与时间体外培养方法培养液添加成分1、取卵方式与时间IVM取卵方式：直接从阴道采集从手术切除的体外卵巢组织上采集IVM的卵母细胞恢复能力受阴道采集时抽吸压力和针头型号的影响：较高吸取压力（大约为56mmHg）和较粗针头有利于卵母细胞恢复。有文献报道，将卵母细胞采集针反复在卵巢基质上抽吸的过程中逐渐增加抽吸压力，可采集到更多卵泡。IVM取卵时间：由于未成熟卵母细胞主要来源于小卵泡，所以取卵技术略不同于含有成熟卵子的大卵泡。取卵难度相对大一些，因为卵巢游动度较大，患者容易产生不适，所以一般都在麻醉下完成取卵。一般每个患者大约可以取到7～30余个不成熟卵子。卵泡越小，卵母细胞恢复减数分裂进而发育成熟的能力越弱，但体积较大的优势卵泡可分泌大量雌激素而引起周围卵泡闭锁。因此，过早或过晚结束培养都会对卵母细胞的质量产生不利影响。目前，一般在卵泡直径达到10～12mm时结束培养100um2、体外培养方法•体外培养方法可分为如下几类：微滴（一维）培养将卵泡直接放在培养皿中进行一维法培养时，不利于卵母细胞与其周围颗粒细胞之间的相互作用，且卵泡因重力作用而失去三维结构，进而影响卵母细胞生长二维培养利用颗粒细胞或STO细胞在培养皿底部铺饲养层可构建二维培养环境三维培养在海藻酸钠水凝胶等特殊材料包裹后，包埋培养可构造三维立体结构的卵泡培养环境“两步法”在三维培养环境中培养窦前卵泡至窦状卵泡阶段，随后去除部分卵泡，使细胞密度降低，从而促进卵母细胞生长，并最终获取成熟卵母细胞。3、IVM实施方案•根据Gn使用情况，将IVM实施方案大致分为以下几种：经典IVM方式最早的IVM技术方案中不加入任何Gn。当卵泡直径达到10～12mm而未形成优势卵泡时结束培养。该方案不仅适用于PCOS患者，还适用于排卵正常的个体添加卵泡刺激素（FSH）培养FSH对卵泡发育和卵母细胞成熟十分重要，FSH水平不足或缺乏会影响排卵。在培养时加入小剂量FSH可增加获卵数、体外培养成熟率以及妊娠率。一般在体外培养的第3天加入100～150U的FSH，连续3d至卵泡达到10～12mm添加人绒毛膜促性腺激素（hCG）培养在培养时，加入hCG（一般为10000U）有助于卵母细胞减数分裂的恢复，并能够增加妊娠率。联合使用FSH和hCG当体外培养卵母细胞时，联合使用FSH和hCG可进一步提高获卵数、卵母细胞成熟率、种植率和临床妊娠率一般来讲，未成熟卵子需要在体外培养24～48小时，国际报道的成熟率可以达到60～75%。这些体外成熟卵子可以体外受精发育成胚胎，进行宫腔移植。三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估（图：胚胎发育的不同阶段）1、卵母细胞体外成熟技术的优化培养液的优化：将未成熟的小窦状卵泡从人体内取出后，卵母细胞所处环境即发生变化，与其直接接触的培养液成分将对卵母细胞的发育、成熟、受精能力等产生重要的影响。适当添加促性腺激素Gn有助于获取高质量的IVM的卵母细胞添加促性腺激素释放激素GnRHa可促进人IVM的卵母细胞的成熟和排卵添加表皮生长因子EGF可增加人IVM的成功率添加减数分裂抑制剂可延迟IVM的卵母细胞减数分裂的恢复添加cAMP因子可促进减数分裂的发生，有利于IVM的卵母细胞的发育三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估1、卵母细胞体外成熟技术的优化体外成熟卵子的体外授精：既可采用常规体外授精技术完成受精，或用单精子卵胞浆内注射（ICSI）技术授精。为了提高受精率，卵子体外成熟后一般建议选择ICSI授精方式。授精方式的优化：单精子显微注射流程图三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估1、卵母细胞体外成熟技术的优化•胚胎移植前的优化：移植前胚胎的辅助孵出（AH）：就是采用激光在胚胎的透明带上产生一个薄弱点，辅助囊胚易于孵出着床。因为卵子体外成熟的培养时间较长，理论上卵子的透明带结构可能比较厚硬，为了提高着床率，移植前往往建议进行胚胎的辅助孵出。三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床应用评估2、卵母细胞体外成熟技术的临床应用评估由于卵泡未成熟体积小，取卵需要特定装备与高超技术，培养技术也非同一般，体外受精则必需显微操作术前不需要应用昂贵药物刺激，可以避免药物治疗副作用，大大减少费用且降低本病常见的促排卵引起的卵巢过度刺激综合征风险优点缺点一、Ghrelin对卵母细胞成熟的影响1Ghrelin的结构及其分布2Ghrelin受体的信号通路及其分布3Ghrelin对卵母细胞成熟的影响Ghrelin的结构哺乳动物中，Ghrelin被发现是一种协调能量和生殖活动平衡的促进食欲的胃肠激素，是生长激素促分泌物受体（Growthhormonesecretagoguereceptor，GHS-R）的内源性配体Ghrelin是28个氨基酸组成的肽，其第三个丝氨酸是N端酰化的，这是ghrelin活性所必需的。大鼠和人类的Ghrelin只有两个氨基酸残基的差异图1调节垂体生长激素释放（引自KojimaMandKangawaK,2005)图2人和大鼠Ghrelin的结构（引自KojimaMandKangawaK,2005)1Ghrelin的结构及其分布Ghrelin影响食物摄入、睡眠和行为调节细胞增殖分化影响心脏功能与血管阻力影响能量代谢和糖代谢影响胃酸分泌与胃运动影响胰腺外分泌和内分泌功能刺激GH、ATCH、PRL的分泌2Ghrelin的结构及其分布影响生殖功能2Ghrelin受体的信号通路及其分布Ghrelin受体（GHS-R）是典型的七次跨膜G蛋白偶联体，受体有7次跨膜的α螺旋区和3个细胞内和外的氨基酸环GHS-R和GHRH引起GH释放的信号通路（引自TeresaLorenzietal.）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI-3激酶是主要参与激活核转录因子以控制细胞增殖，分化和凋亡的丝氨酸/苏氨酸激酶ghrelin作用ERK1/2和PI-3激酶信号通路（引自ChoiKetal.）3Ghrelin对卵母细胞成熟的影响体外成熟过程中卵母胞Ghrelin和GHS-R1amRNA相对表达量随着成熟进程显著下降Ghrelin蛋白在牛卵母细胞胞质中表达，而GHS-R蛋白则特异性的定位于卵母细胞膜表面，在卵丘细胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表达。FSH抑制卵母细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达，而FSH显著促进卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达；FSHBI解除FSH对卵母细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达的抑制作用和FSH对卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达的促进作用二、褪黑素对卵母细胞成熟的影响1褪黑素的结构及其分布2褪黑素受体及其信号通路3褪黑素Ghrelin对卵母细胞成熟的影响1褪黑素的结构及其分布褪黑素（Melatonin,MT），化学结构为乙酰基甲氧基色胺，分子量为，是首先在松果体中发现的一种胺类物质，褪黑素合成前体是色氣酸主要用途抗击肿瘤改善睡眠调节免疫延缓衰老2褪黑素受体及其信号通路MT1和MT2褪黑素受体信号通路：A:褪黑素和MT1受体结合后激活两条通路，通过Gq偶联受体α-亚单位抑制cAMP的合成及通过βr亚单位增强憐酸肌醇的分解。B：MT2褪黑素和结合后的信号通路。3褪黑素对卵母细胞成熟的影响褪黑素具有抗氧化活性，褪黑素能通过多条途径降低氧化应激，是一种高效的自由基清除剂。图为褪黑素在卵泡中的作用示意图。褪黑素可以调控卵泡壁细胞和颗粒细胞固醇类合成酶的表达而影响类固醇激素的分泌。褪黑素同时可以调控LHmRNA的表达，Bcl2和Casp3的生成，IGF和TGF-β的活性和成熟透导激素的活性。褪黑素能调节颗粒细胞SOD、Gpx和CAT的表达。过多ROS的会引起凋亡和卵泡闭锁，而卵泡内的视黑素可以直接或间接清除ROS而抑制卵泡闭锁，从而使卵泡继续发育为优势卵泡。三、白藜芦醇对卵母细胞成熟的影响1白藜芦醇的结构及其性质2白藜芦醇作用相关信号通路及其分布3白藜芦醇对卵母细胞成熟的影响白黎芦醇（Resveratrol，RES)是一类多龄类化合物，存在于红色葡萄皮、红酒或其他的植物提取物中。1白藜芦醇的结构及其性质分子式相关保健品2白藜芦醇作用相关信号通路在哺乳动物中白黎芦醇是SIRT1的激活剂，能够保护线粒体的功能，除此之外，还具有抗氧化、抗衰老等生物学作用白藜芦醇减少脏器纤维化促进脏器结构功能恢复恢复氧化应激稳态恢复能量代谢稳态3白藜芦醇对卵母细胞成熟的影响白黎芦醇能够提高女性GV期卵母细胞的成熟；白黎芦醇能改善卵母细胞线粒体的功能；白黎芦醇减少纺锤体染色体的异常率从而改善卵母细胞的质量10X40X20X图一10X40X40X图二LH通过EGF旁分泌作用介导卵丘细胞ActivinβA、FS表达调控卵母细胞核成熟模式图