流式多色检测技术原理

流式细胞术多色检测杨培2013.04.09达科为生物技术有限公司流式检测原理流式细胞术多色检测Biolegend产品介绍流式数据分析软件介绍主要内容FCS4—DeNovoSoftware流式检测原理流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种以流式细胞仪为检测手段，可以快速、准确、客观，同时检测单个生物微粒的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。特点:研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等快速、准确、高通量检测多参数、多色荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确定性或定量分析细胞分选特定性状或功能的细胞流式细胞术概述Alexa488Alexa488合成的有机物AlexaFluors,Cydyes,Horizon,Dylight,etc蛋白PE,APC,GFP,mCherry半导体纳米Qdots,Crystalplex,eFluorNC有机聚合物BrilliantVioletAlexa488PECy5Cy5Cy5流式抗体—荧光素CollisionalQuenching荧光素淬灭•Blue（488nm）–FITC–AlexaFluor488–PE–PerCP–PerCP-Cy5.5–PE-Cy5–PE-Cy7–PI–7-AAD•Red（633nm）–APC–APC-Cy7–AF647–AF700•Violet（405nm）–AmCyan–BrilliantViolet421–PacificBlue–BrilliantViolet510–BrilliantViolet570–BrilliantViolet605–BrilliantViolet650–BrilliantViolet711–BrilliantViolet785–Qdot605•UV(360nm）–DAPI流式抗体—常用荧光素耦合荧光素M1M1anti-MouseCD3e,clone145-2C11-PE/Cy5BioLegendCompetitor1耦合荧光素不同厂家，抗体荧光强度不同耦合荧光素对光、对固定剂更敏感液流系统光学系统数据处理系统流式细胞仪及其结构激光光源流动室检测装置：滤光片流式细胞仪—光路图流式细胞仪—信号检测前向角散射光（FSC）：反映相对大小侧向角散射光（SSC）：反映细胞粒度及细胞内相对复杂性前向角检测器FSCLaser测向角检测器sSC激光光源信号检测—散射光信号SSCFSC全血溶红后流式检测图外周血细胞散射光双参数点图信号检测—荧光素荧光信号样本管加入正常抗体同型对照加入同型抗体阴性对照加PBS抗体FC段非特异性结合位点（普遍存在）检测抗原位点荧光组成1、细胞自发荧光2、非特异性标记荧光3、特异性标记荧光荧光组成1、细胞自发荧光2、非特异性标记荧光荧光组成1、细胞自发荧光非特异荧光信号的排除TruStainFcX(anti-mouseCD16/32),#101319humanTruStainFcX,#422301去除死细胞的非特异荧光信号死细胞因细胞膜已失去完整性，所以很容易与抗体结合，造成非常强的非特异性染色。一般来说，当细胞标本中的死细胞数目超过5%时，需重新采集标本，或使用“死细胞排除试剂盒”来排除死细胞的干扰。实验计划试剂选择（死活细胞检测）进行活细胞检测，无需细胞固定（如细胞分选）PI,或者7-AAD,或者ZombieAqua™先固定细胞，在进行流式抗体染色ZombieAqua™先进行流式抗体染色，再固定细胞ZombieAqua™做胞内流式检测ZombieAqua™荧光补偿调节方法APC-A单参数直方图双参数散点图三维图等高线图流式数据分析流式细胞术常用分析软件BDcellquestBDFacsDiva。。。仪器自带分析软件第三方分析软件流式细胞术多色检测Alexa488Alexa488合成的有机物AlexaFluors,Cydyes,Horizon,Dylight,etc蛋白PE,APC,GFP,mCherry半导体纳米Qdots,Crystalplex,eFluorNC有机聚合物BrilliantVioletAlexa488PECy5Cy5Cy5流式抗体--荧光素种类BrilliantVioletTM421BrilliantVioletTM510BrilliantVioletTM570BrilliantVioletTM605BrilliantVioletTM650BrilliantVioletTM711BrilliantVioletTM785BrilliantVioletTM荧光素家族(7个成员）BrilliantViolentTM简称“BV”，是诺贝尔奖获得者发明的“最新一代”的荧光染料，“BV”染料是有机聚合物，它有很强的光吸收能力（消光系数）和光转换能力（量子产率），这些物理特性使“BV”的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。BrilliantViolentTM荧光素家族，包括：BV421，BV510,BV570，BV605，BV650，BV711，BV785七个成员，充分利用流式细胞仪405nm激发管，与其它各种荧光素兼容性好。Biolegend公司可以提供最新最全的BV系列荧光抗体，BD目前只推出了两种：BV421,BV605！BrilliantVioletTM荧光素家族荧光素荧光强度激发光滤光片平行荧光素BrilliantVioletTM4215405nm450/50PacificBlueBrilliantVioletTM5104405nm510/50或525/50BDHorizon™V500和AmCyanBrilliantVioletTM5703405nm585/40PacificOrangeBrilliantVioletTM6055405nm605/12或510/20eFluor®605和Qdot®605BrilliantVioletTM6504405nm660/20eFluor®650和Qdot®650BrilliantVioletTM7114405nm710/50eFluor®700NC和Qdot®705BrilliantVioletTM7853405nm780/60Qdot®800带有不同荧光素的细胞细胞表面受体针对细胞表面不同蛋白的标记不同荧光素单兊隆抗体细胞与多种抗体共孵育流式多色染色什么是多色？降低实验费用减少标本使用量减少实验用时充分利用流式细胞仪性能有助于发更好的文章流式多色染色为什么要选择多色？流式多色染色如何进行流式多色染色，需要考虑哪些因素？所要检测指标：抗原表达情况仪器配置：型号,滤光片对照设置：FMO（FluorescenceMinusOne）荧光扣除对照强表达抗原，选弱荧光素，也可选择强荧光素弱表达抗原，一定要选强荧光素抗原与荧光素常用的荧光素强度淋巴细胞表面Marker的抗原表达量抗原与荧光素流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及分析型流式，科研临床领域都涉及。分析型流式，有几种型号，临床领域为主Attune分析型流式，科研领域为主分析型流式，科研领域为主流式细胞仪BD流式细胞仪主要型号FACSCalibur单激光三色，或双激光四色，市场覆盖率最高，分析型FACSCanto双激光六色，分析型FACSAria双激光六色，或三激光八色，分选型为主，也可以分析FACSLSR双激光六色，三激光八色，或者更多激光，分析型最高配FACSInflux激光多个，高端分选型流式细胞仪Beckmancoulter流式细胞仪主要型号EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型FC500单激光五色或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型CyAn三激光九色，分析型MoFloXDP，高端分选型流式细胞仪流式细胞仪•BD–光路配置可调节:Fortessa,ARIA,LSRII,Cantoforresearch–光路配置不可调节型:clinicalCanto,Calibur,Scan•BC–光路配置可调节型:Astrios,Gallios,MoFlo–光路配置不可调节型:CyAN，etcCantoandARIAtypical光路图BIOLEGENDCONFIDENTIAL488nm405nm633nmLSRII,FortessaandARIA光路图BIOLEGENDCONFIDENTIALInvitrogenProprietary&ConfidentialQDot705QDot605QDot585QDot655QDot565660/40APCAlexa680710/50APCCy7PECy7PECy5PETRPECy5.5PE-Green710/50SSCBlueFITCPE-BlueQDot545AmCyanCasBlue535LP405nm635nm488nm532nmBIOLEGENDCONFIDENTIALFMO对照及门的设置FullpanelIFNgunstimFMOIFNgBV570FullpanelIL-2unstimFMOIL-2APCFullpanelIL-4unstimFMOIL-4PEFullpanelIL-17aunstimFMOIL-17aBV421AntibodyCloneDilutionIL-17aBV421BL1681:50Live/DeadAquaIFNgBV5704S.B31:20CD8QD605LT81:100IL-4PEMP4-25D21:5CD45ROAF488UCHL11:5CD45RAPE-Cy7HI1001:10CD4PE-Cy5RPA-T41:5IL-2APCMQ1-17H121:10CD3AF700UCHT11:50流式抗体系列--荧光素评价指标产品介绍Biolegend公司,成立于2002年，一直致力于高质量的流式抗体、试剂盒等相关产品的研究和生产。赖振光，CEOGeneLay，赖振光是原BDPharMingen公司的缔造者。公司聚集了一大批来自BDPharMingen的丏业杰出人士，并通过其自身的先天优势，与世界知名实验室和研究所都有良好的合作关系。在2009年成为美国哈佛大家的“首选”抗体供应商！！！BioLegend简介BioLegend产品体系流式检测抗体ELISA检测试剂盒重组细胞因子体内外功能学实验抗体WesternBlot检测试剂克疫共沉淀试剂克疫荧光检测抗体克疫组化检测抗体细胞免疫分型细胞因子及趋化因子检测黏附因子检测用于癌症研究干细胞、T调节细胞研究先天免疫研究细胞周期、凋亡检测蛋白修饰抗体研究流式抗体ELISA试剂盒重组细胞因子LEAF和Ultra-LEAF™系列抗体BioLegend产品体系流式抗体功能性T细胞Th1细胞Th2细胞Th17细胞Tfh细胞Th9细胞Th22细胞调节性细胞Treg细胞Breg细胞MDSC细胞先天克疫细胞NK细胞巨噬细胞DC细胞嗜碱粒细胞干细胞胚胎干细胞造血干细胞间充质干细胞其它细胞红细胞成纤维细胞表皮细胞血小板…细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、…CellMarkerCellMarker抗体检测种属:人小鼠大鼠灵长类交叉种属抗体试剂盒:“一步法”试剂盒;LineageCocktail试剂盒流式抗体lineage混合抗体产品：应用：例如通过排除T细胞,单核细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,B细胞和NK细胞，来负选出DC细胞和嗜碱性粒细胞鉴定不具备分化细胞标记的造血祖细胞Lineage混合抗体产品ELISA试剂盒转化生长因子-β（TGF-β）：是一类细胞分泌蛋白，存在至少三个亚型:TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3.TGF-β的生物学功能：诱导细胞凋亡抑制作用1)抑制T、B细胞增殖2)阻断细胞周期调节T细胞的分化1)Treg2)Th17限制机体内的生