无缝克隆

19|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012GBclonart基因克隆技术120|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012April23,2012TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低耗时较长需要特定限制性酶切位点传统的分子克隆方法221|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012GBclonart克隆技术的优点:April23,2012任意载体任意基因片段不附加任何多余序列不受限制性内切酶酶切位点的限制322|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012GBclonart基因克隆技术原理示意图GBclonart是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！42℃，30min单管反应5045|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/20121.连接效率很高当前产品质量不符合要求，特别是buffer对连接的效率影响特别大，还有好多奸商购进别的公司的产品然后回来稀释卖出。2.背景低T4连接有时候背景很高，如果遇到特别的基因还很难连接进去，而LIC连接要对载体进行特殊的改造，这样对一些特殊的构建就有一定的局限性，而GBclonart可以做到克服这样的困难。3.特殊连接这种方法，对于一些特殊的链接特别有帮助，如你片段里有很多酶切位点，你在苦苦需找用什么酶切的时候，浪费了你的好多脑细胞，而这种方法的好处是不用考虑你片段有什么酶切位点，只要考虑你在载体什么位点插入就可以了。4.多片段的链接GBclonart基因克隆特点6|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012克隆成功的关键线性化载体制备引物设计、PCR条件克隆反应设置克隆感受态细胞的选择选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒7|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012载体线性化:April23,2012双酶切处理PCR扩增采用酶切或PCR扩增方法将载体线性化。质粒的线性化不彻底将导致阴性克隆的产生，所以一般建议通过双酶切。如使用PCR扩增获得线性化质粒，所用的酶应选用高保真酶（如Pfu酶）。8|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012引物设计要点：1)引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列2)引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列9|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012克隆策略——对PCR片段的处理有无杂带？有无引物二聚体？PCR产物无杂带，有引物二聚体均有或有杂带均无GelExtractionKitPCRPurificationKit基因克隆、转化10|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012Gbclonart重组反应重组酶体系线性化载体目的基因片段反应液直接转化GBclonart重组反应42℃30min重组反应：GBclonart反应液15μl线性化载体xμlPCR片段xμl———总体积20μl11|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012I.线性化载体II.PCR片段III.反应产物阳性阴性对照GBclonart无缝克隆结果：GBclonart反应液15μl线性化载体xμlPCR片段xμl———总体积20μl12|GenebankBiosciencesProprietary&Confidential|4/23/2012如何选择PCR酶？使用任何PCR酶都可以，但推荐使用高保真Pfu酶。PCR产物的结构有限制吗？没有特别的限制。PCR产物末端有无A尾都能使用。载体末端的结构有限制吗？没有特别的限制。载体末端是平滑末端或是粘性末端都能使用。引物附加序列如果不是15个碱基可以吗？引物附加序列为15～20个碱基都可以。GBclonart试剂盒的保存应注意什么？-20℃或-80℃保存。GBclonart无缝克隆注意事项：