生物工程下游技术第五章-细胞破碎、蛋白质复性和固液分离

第二篇目标产品的分离与纯化第五章细胞破碎、蛋白质复性和固液分离细胞破碎固液分离初级分离(粗)纯化精制下游技术基本过程下游加工技术的重要性1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。几种产品在发酵液中的浓度产品典型浓度（g/L）抗生素25氨基酸100酒精100有机酸100酶20蛋白质10下游加工技术的特点1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。•产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求第一节概述基因工程生物制品分离纯化:工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高分离纯化极其重要基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品基因工程制品分离纯化的一般流程•初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。•纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。产物提纯过程包括两个基本阶段：第二节细胞破碎•目的：释放细胞内含物。•分类：按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。问题：破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物破碎方式机械法固体剪切作用珠磨法压榨液体剪切作用高压匀浆超声破碎非机械法干燥处理溶胞作用酶溶法化学法物理法细胞破碎方法分类图1、高压匀浆法•组成：高压泵和匀浆阀•作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。高压匀浆阀结构示意图进液口出液口阀座碰撞环阀杆高压匀浆器19.6-25.4MPa适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎高压匀浆法动力学方程•破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。•破碎率---操作压力----温度控制----能耗温度对活性物质的失活作用提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：23.8℃/100MPa高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆过程中产生的热→蛋白质和酶的失活温控和能耗•堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用•温度高易失活，能耗大。存在的问题2、高速珠磨法•原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。几种常见珠磨器动力学方程•间歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=Kt其中，D=(1+K1/j)j•连续操作：Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`上式中，t是破碎时间；K、K1、K`是破碎速度常数；V是破碎室内悬浮液的体积；f是进料速度；是平均停留时间；j是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。•采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好;•能耗与细胞破碎率成正比;问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？温控和能耗高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目高压匀浆法高速珠磨法操作参数少多，液体损耗大连续操作时配备热换器进行级间冷却兼具破碎和冷却，减少产物失活达到较高破碎率需循环2-4次一次操作适用范围团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜几乎所有的微生物细胞，包括含有包含体的基因工程菌的破壁X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。3、超声破碎•机理：声频高于15～20kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。•破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。•优点：操作简便，液量损失少•存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。•空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度看得到的空化现象超声波破碎仪大功率超声波破碎仪4、化学渗透法•作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。•问题：EDTA、甲苯、TritonX-100、盐酸胍和脲的作用机理？P70EDTA：破坏细胞的外层膜甲苯：溶解细胞膜的磷脂层TritonX-100：溶解内膜的双磷脂层盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液•优点（相对机械破碎）：①对产物释出有一定的选择性；②细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；③核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。•缺陷：①时间长，效率低；②化学试剂有毒；③通用性差5、酶溶法•机理：利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。•常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、β-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶(chitinase)、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。优点：①一定的选择性；②细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程缺点：（只能用于实验室）①产物抑制造成效率低下；②溶酶价格高；③通用性差，不易确定最佳条件；6、微波加热法•机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：•一般只适合对热稳定物质的分离；•被处理的物料要具有良好的吸水性；•不适于富含淀粉和树胶等的天然植物机械破碎法与非机械破碎法的比较比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜碎片大小碎片细小细胞碎片较大内含物释放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）时间，效率时间短，效率高时间长，效率低设备需专用设备不需专用设备通用性强差经济成本低成本高应用范围实验室，工业范围实验室范围克隆表达的产物基因工程细胞蛋白质没有活性，一级结构正确，立体构型错误，无生物学活性！——包涵体第三节蛋白质复性难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构——包涵体SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）•缺少某些协助因子（分子伴侣？？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。应该考虑的事：设法减少包含体的形成！减少包涵体形成的策略1、降低重组菌的生长温度降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、pH等。2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂•蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。如何使包涵体的构型复原成正确状态？包含体的分离及溶解①分离包含体：对培养收集的细胞进行破碎(高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后离心(5000~20000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。②洗涤：除去包涵体沉淀的脂类和膜蛋白，一般加去污剂（TritonX-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）。以避免包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。③溶解：a.包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。以异氰盐酸胍的增溶效果最强，尿素稍差；b.去污剂（如SDS）可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；c.酸（如70%甲酸）可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。d.对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。e.同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。蛋白质的折叠机理•目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。蛋白质的具体步骤可用下式描述：•伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体核糖核酸酶的变性和复性示意图(A)天然核糖核酸酶(B)变性失活(C)“错乱”核糖核酸酶错误发生的机制①复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。②伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。不同条件下具体复性方式1、透析、稀释和超滤复性法：最传统、应用最普遍，原理--使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。2、高蛋白浓度下的复性方法：（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。）①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。②温度跳跃策略：变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。③复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。3、添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。常用促进剂：a、共溶剂：如通过与中间体特异的形成非聚集复合物，阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程