原位杂交探针设计原则

原位杂交探针大体可分为三类：寡核苷酸探针，cDNA探针，RNA探针。寡核苷酸探针由25bp左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切体，cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由于探针式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果设计合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解。查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色，2000年以后的文献常使用RNA探针。许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原位杂交探针设计方法，我们可以采用RNA探针。文献中很难找到关于RNA探针设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针。借鉴爪蟾中原位杂交探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍。1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST比对分析，比对数据库选择mousegenome+transcript，比对程序选择somewhatsimilarsequence。ZebrafishseqRNAs得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择可变区。如下图黑色框区域。2.估计黑色框碱基在FGF10mRNA中的大致范围，在这个范围内选择长约500bp的序列设计探针。根据上图信息，我们选择FGF103000~3800的范围进行探针设计。agcacagaggcacaatgctttggtttatgggtataggttgcattt3301tgtggtgttctttcaacttgttttctgacaaatgggatttttaaaatgtatacttcttgt3361ggttggattctgtatgttagagtttaattggtaactgagtctaaaggctctaatgtaatg3421aatctctagaagaactaggtatctttttttacttttattttaaaataataattatacctg3481acacatgaccatggaccacccacaaccaaaattaaatgtttggggagacaaactatagta3541ttcagtgacaagggtaacagcaaatagtgcagacgttggattcttatttcactttgccat3601ttagattactaaagagactatgtgtaaacagtcatcattatagtactcaagacattaaac3661agcttctagcaaaatgtatcaaagcttgcagagtccaaaaatagaaaacatctttccccc3721tctcccaccctacatttccccctgtatgcatcctaacagagat底纹标注的为引物序列3.将设计好的探针序列在UCSC上再次比对分析，genome选择mouse，querytype选择translatedRNA，点击submit，保证搜索出的条目只有目标基因，如果存在其它非目标匹配项（既不是来自FGF基因的序列），则需要重新选择一段探针序列。你可以点击browser浏览一下所设计的探针序列是否是FGF10的序列以及所在位置。在选择探针序列时，尽量选择3’端的区域，避开可能的选择性剪切，同时也要避免mRNA的末端序列，因为可能存在翻译终止序列，影响以后的体外转录效率。经过上述分析后，探针序列可以较好的避免家族基因的保守序列，确保特异性。我们可以针对每个基因设计两个探针，后面比较一下哪个探针杂交效果最好。