对照品溶液的制备

中药分析学第六章中药的含量测定第一节常用含量测定方法目录一、化学分析法二、光谱分析法三、色谱分析法四、联用技术44包括重量分析和滴定分析适用：主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药优点：仪器简单，结果准确缺点：灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定一、化学分析法55（一）重量分析法1.挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：干燥失重、水分；灰分及炽灼残渣的测定2.萃取法：被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同而分离如：总皂苷、总有机酸、总生物碱3.沉淀法：沉淀反应%100%smFxm66例：芒硝中硫酸钠的含量测定（重量法）取芒硝约0.4g，精密称定，加水200ml溶解后，加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液（约20ml），至不再生成沉淀，置水浴上加热30分钟，静置1小时，用无灰滤纸或称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0.6086相乘，即得供试品中含有硫酸钠的重量。77（二）滴定分析法酸碱滴定法：测定生物碱、有机酸、内酯类沉淀滴定法银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物四苯硼钠法：+生物碱→白色沉淀亚铁氰化钾法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸铵法）：测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量氧化还原滴定法：酚类、糖类及矿物药中Fe、As等88计算原理（1）直接滴定（2）返滴定%100%TsTVFxm%100%0WVVFTx99例：半夏中总有机酸含量测定（酸碱滴定法）取本品粉末（过四号筛）约5g，精密称定，置锥形瓶中，加乙醇50ml，加热回流1小时，同上操作，再重复提取2次，放冷，滤过，合并滤液，蒸干，残渣精密加入氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）10ml，超声处理（功率500W，频率40kHz）30分钟，转移至50ml量瓶中，加新沸过的冷水至刻度，摇匀，精密量取25ml，照电位滴定法（通则0701）测定，用盐酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白实验校正。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于5.904mg的琥珀酸（C4H6O4）。1010二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法1.定量原理2.特点灵敏，但不具分离功能，常用于总成分的测定，如总生物碱、总黄酮、总皂苷、总多糖等测定CAEl11113.定量方法（1）吸收系数法不需对照品；对测量条件、测量仪器要求较高（2）标准曲线法–5~7个标准溶液；–回归方程的相关系数不得小于0.999–供试品溶液的吸光度值应在标准曲线范围内（3）对照品比较法–对照品溶液和供试品溶液的制备应平行操作–对照品溶液的浓度应在供试品溶液中待测组分浓度的100%±10%之间。1%1cmACElCACA对照品样样对照品1212（二）荧光分析法1.适用样品本身具有荧光或者能转化为荧光衍生物的物质，常具有刚性平面结构的共轭体系；蛋白质和酶、部分甾体、黄酮、香豆素、蒽醌和生物碱类物质等，可用荧光法直接测定或经过衍生后用荧光法测定2.特点具有灵敏度高、操作简便的优点中药成分复杂，干扰大，常与薄层色谱、高效液相色谱联用进行含量测定13133.定量方法（1）标准曲线法同紫外可见分光光度法。在测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度。然后测定一系列对照品溶液的荧光强度（Rr），扣除空白溶液的荧光强度（Rrb）后，以（Rr-Rrb）对浓度绘制标准曲线。在相同的条件下测定供试品溶液及其空白溶液的荧光强度，根据工作曲线计算供试品的浓度。选择一种激发光和发射光波长与供试品近似但对光稳定的物质作为基准溶液校正仪器的灵敏度。如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。1414（2）比例法注意：荧光强度与浓度的线性范围较窄，（Rx–Rxb）/（Rr-Rrb）应控制在0.5~2之间，如若超过，应调整溶液浓度后再测。rrbrxbxxcRRRRcCx为供试品溶液浓度，Cr为对照品溶液浓度1515（三）原子吸收光谱法1.基本原理当待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时，谱线被基态原子吸收，辐射光强度减弱，通过测定辐射光强度减弱的程度，求出供试品中待测元素的含量。2.特点优点：灵敏度高、选择性好、操作简便、测定范围广缺点：线性范围窄、测定不同元素需要不同光源AKC16163.定量方法（1）标准曲线法配制含待测元素的对照品溶液至少5份，浓度依次递增，并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试剂，同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后，依次测定空白对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度，以每一浓度3次吸光度读数的平均值为纵坐标，以相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。然后测定供试品溶液的吸光度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量。浓度A01717例：健脾生血颗粒中硫酸亚铁含量测定对照品溶液的制备：取铁单元素标准溶液适量，用水稀释成每1ml含铁100μg的溶液，作为标准溶液。精密量取标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml和3.0ml，分别置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取1g，精密称定，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。测定法：取对照品溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法（通则0406第一法），在248.3nm的波长处测定，计算，即得。1818（2）标准加入法适用于试样基体干扰较大，又没有纯净的基体空白，或者测定纯物质中极微量的元素时注意：①被测元素的浓度应在通过原点的标准曲线线性范围内，最少采用四个点作外推曲线；②斜率不能太小；③此法可扣除基体的干扰，但不能扣除背景的干扰，因此必须进行试剂空白等背景的扣除。A加入的对照品浓度01919三、色谱分析法（一）高效液相色谱法特点：高分辨，高灵敏，快速，适用范围宽，自动化程度高。适用性：特别适合中药的定性定量分析，《中国药典》中大多数中成药的含量测定采用此法。20201.实验条件选择(1)色谱柱固定相常用键合官能团结构适用范围硅胶无正相色谱分析氰基柱-(CH2)3CN可用于正相或反相色谱分析。正相类似于硅胶吸附剂，但溶质保留比硅胶低；反相适用于分离极性相对较强的样品。氨基柱-(CH2)3NH2可用于正相色谱、反相色谱及阴离子交换色谱。《中国药典》2015年版（一部）山豆根和苦参中苦参碱、使君子中葫芦巴碱、鲜益母草胶囊中盐酸水苏碱含量测定采用氨基柱。C18-(CH2)17CH3反相色谱和离子对色谱，适用于大部分非极性到极性样品，《中国药典》2015年版（一部）HPLC法中95%以上使用C18键合相。2121固定相常用键合官能团结构适用范围C8-(CH2)7CH3反相色谱和离子对色谱，适于分离中等极性到极性的样品，与C18相比，疏水作用弱，适于极性略强的样品和分子较大的样品。《中国药典》2015年版（一部）土荆皮中土荆皮乙酸、甘遂中大戟二烯醇、辛夷中木兰质素、罂粟壳中吗啡含量测定采用辛基硅胶键合相。苯基-(CH2)3C6H5反相色谱，与C8分析效果相似，但对带苯环的试样有更高的选择性，《中国药典》2015年版（一部）忍冬藤中马钱苷、金银花中木犀草苷的测定采用苯基硅胶键合相。阳离子交换柱-(CH2)3C6H5SO3Na阳离子交换色谱，适用于阳离子样品，《中国药典》2015年版（一部）益母丸中盐酸水苏碱的含量测定采用强阳离子交换柱。阴离子交换柱-(CH2)3C6H5CH2N(CH3)3Cl阴离子交换色谱，适用于阴离子样品2222（2）流动相和洗脱方式流动相水为主体，加入甲醇、乙腈等调节极性易电离的组分，可加入适当pH值的缓冲溶液改变样品带电荷的状态，从而改变其保留值。洗脱方式等度洗脱：适于组分较少、性质差别不大的样品梯度洗脱：适于分组较多、性质差别较大的复杂样品2323（3）检测器①紫外检测器适于有紫外可见吸收的物质，适合大多数中药定量原理：Lambert-Beer定律分类：可变波长型检测器和二极管阵列检测器特点：具有灵敏度高、线性范围宽、对流速和温度波动不灵敏，可用于梯度洗脱注意流动相的截止波长必须小于检测波长24242525②蒸发光散射检测器原理定量原理特点：通用型检测器，但灵敏度低适用性：主要用于对紫外响应较低的糖类、甾体类、氨基酸等样品的分析bIkmlglglgIbmk2626③示差折光检测器原理：组分和流动相折光率之差进行检测特点：通用型的检测器，但灵敏度低，不能用于痕量分析，不适合梯度洗脱适用性：糖类、甾体类④荧光检测器灵敏度比紫外检测器高，但只适用于能产生荧光或衍生物能产生荧光的物质常用于氨基酸、多环芳烃、酶及甾体化合物等27272.系统适用性实验包括色谱柱的理论板数、分离度、灵敏度、重复性和拖尾因子五个指标。其中分离度和重复性更具实用意义。系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整。2828（1）理论板数（n）考察柱效21/25.54()RtnW216()RtnW2929（2）分离度（R）考察分离效果除另有规定，待测峰与相邻峰的分离度应大于1.5。（3）灵敏度定性：信噪比不低于3；定量：信噪比不低于1021)(212WWttRRR3030（4）重复性考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0％。（5）拖尾因子（T）105.02dWThT应在0.95～1.05之间式中:W0.05h为0.05峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的距离。hW05.0h0.05hW0.05hd131313.定量方法（1）内标法①内标加校正因子法–各品种项下的规定，精密称（量）取对照品（R）和内标物质（S），分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：–再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量////RRRsssssRRfmAACffmAACXXsACfCsA3232操作：配制一系列不同浓度的对照品溶液，其中加入等量的内标物，在相同的条件下，分别测定各浓度下对照品和内标物的峰面积的比值，再以峰面积的比值对对照品的浓度制作标准曲线。在待测样品中加入相同量的内标物，在完全相同的实验条件下测定，得到待测组分和内标物的峰面积。根据标准曲线计算待测组分的浓度。特点：避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果造成的影响。标准曲线②内标标准曲线法3333（2）外标法①外标标准曲线法②外标一点法XXRRACCA标准曲线AxCx3434（二）气相色谱法3535适用性：挥发油及其他挥发性组分的含量测定，还可用于水分、乙醇量的测定。特点：优点：分离效能高、选择性好、灵敏度高、速度快缺点：对挥发性差或遇热易分解破坏的物质难以分析分类1.按固定相状态分类：气固GC、气液GC2.按分离原理分类：吸附GC、分配GC3.按色谱柱分类：填充柱GC、毛细管柱GC36361.色谱条件选择（1）固定相固体吸附剂：高分子多孔小球、分子筛等，用于水分和含羟基（醇）化合物的测定。固定液：甲基聚硅氧烷（非极性，如DB-1）5%苯基-95%甲基聚硅氧烷（弱极性，如DB-5）50%苯基-50%甲基聚硅氧烷（中等极性，如DB-17）聚乙二醇（极性，如PEG-20M）通常根据试样的极性，依据相似相溶的原则来选择固定液的种类。3737