实验四-果蔬维生素C-(抗坏血酸)的测定(荧光法)

实验四果蔬维生素C(抗坏血酸)的测定（荧光法）抗坏血酸溶于水，稍溶于丙酮与低级醇类。结晶抗坏血酸稳定，水溶液易氧化，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是在有氧化酶及痕量铜、铁等重金属离子存在时，可促进其氧化破坏进程。酸性、冷藏、隔氧，可延缓食品中抗坏血酸的破坏。国内外用于食物中维生素C含量测定的主要方法有三种，即荧光法、2，4二硝基苯肼法、2，6二氯酚靛酚滴定法。2，6二氯酚靛酚滴定法只能测定食物中还原型抗坏血酸。由于脱氢型抗坏血酸在人体内与还原型抗坏血酸具有同样的生理功能。在一般情况下，测定食物中总抗坏血酸。2，4二硝基苯肼法和荧光法都是测定食物中总抗坏血酸含量的方法。2，4二硝基苯肼法是比色法，易受杂质干扰，灵敏度较低，而荧光法的灵敏度高于比色法2～3个数量级。另外，2，4二硝基苯肼法采用85％的浓硫酸作溶剂，实验时不易操作。荧光法利用硼酸对脱氢抗坏血酸的掩蔽作用可测出杂质的荧光值，从而提高方法的专一性。因此，荧光法具有灵敏度较高、选择性好、易于操作等优点，但此方法易受仪器条件的限制，所以国标方法中选用荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，而将2，4二硝基苯肼法作为第二法。一、实验目的与要求1理解食物中维生素C的分布规律以及维生素C的理化特性。2学会用常规的比色法测定食物中维生素C的操作技巧。3理解测定维生素C的基本原理。二、实验原理1样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。2脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.22g/ml。3适用范围根据GB12392—1990进行检测，本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。三、实验仪器与试剂1仪器（1）实验室常用设备；（2）荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计；（3）捣碎机。2试剂配制（1）本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯级试剂。（2）偏磷酸乙酸液：称取15g偏磷酸，加40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10d。（3）0.15mol/LH2SO4：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。（4）偏磷酸乙酸硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同偏磷酸乙酸液的配制。（5）50％乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。（6）硼酸乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液中。临用前配制。（7）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。（8）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加以0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。变色范围：pH＝1.2红色pH＝2.8黄色pH＞4.0蓝色（9）活性炭的活化：加900g炭粉于1L1＋9盐酸中，加热回流1～2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。（10）标准液①抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸乙酸液溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。②抗坏血酸标准使用液（100μg／ml）：取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH，如其pH大于2.2，则应用偏磷酸乙酸硫酸液稀释。③标准曲线的制备：取标准溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5ml、1.0ml、1.5ml和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。四、实验步骤全部实验过程应避光。1样品制备称取100g鲜样，加100g偏磷酸乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸乙酸硫酸溶液稀释，使pH为1.2，匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40～100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。2氧化处理分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。3各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。4各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明“样品”及“样品空白”。5于“标准空白”及“样品空白”溶液中各加5ml硼酸乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。6于“样品”及“标准”溶液中各加入5ml50％乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。7荧光反应：取“标准空白”溶液、“样品空白”溶液及上一步中“样品”溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向备管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。五、实验结果与分析x=ρVm×f×101000式中：x——样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量（mg／100g）；ρ——由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度（μg／ml）；m——试样质量（g）；f——样品溶液的稀释倍数；V——荧光反应所用试样体积（ml）。【例】测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每1ml含2.5、5.0、7.5μg及10μg样品，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值作标准曲线。由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸(μg/ml)，按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。如：取制备好的辣椒样品工2.138稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml，样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当于标准抗坏血酸的2.23μg。2.23×1002.138×5010×1001000=52（mg/100g）六、实验报告七、注意事项1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸乙酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。2某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量，我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。