16SrRNA实时荧光定量PCR检测肠道菌群的研究-张小贤

○16SrRNAPCR张小贤1,钱　香2,楼正青2,陈莹莹3,沈岳良3(1.浙江医学高等专科学校,浙江杭州310053;2.杭州市中医院,浙江杭州310007;3.浙江大学医学院国家理科基地,浙江杭州310058)　　[]　目的:应用细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、大肠杆菌(E.coli)、肠球菌(Enterococcus)的引物并对肠道的这4种细菌菌属进行定量测定,绕过分离培养环节,以微生物rRNA/rDNA基因作为种属鉴别序列,确定肠道菌群的情况。方法:采用腹腔注射链脲菌素(STZ)的方法建立小鼠糖尿病模型,分别检测小鼠肠道主要的菌群。结果:造模成功小鼠血糖升高(12.3mmol/L,P0.05)时,肠道益生菌(双歧杆菌,乳酸杆菌)数量降低(P0.05),而大肠杆菌、肠球菌数量增加(P0.05)。结论:小鼠糖尿病模型可引起肠道菌群失调,荧光定量PCR是一种特异性高、敏感性强的定量方法,可正确定量肠道中的细菌菌群数量。　　[]　小鼠;糖尿病;16SrRNA;肠道菌群　　[]　G644　　[]　A　　[]　1002-1701(2010)06-0128-02　　,,。,,16SrRNA,800。,:2,,,。16SrDNA,PCR[1]、、,。、1.主要试剂。(Tris)、(EDTA)、();();(SDS)、K、、DNA();DNAMarkerTaqDNA(Qiagen)。2.动物模型制备。(18-22g),,。18h,STZ(80mg/kg),72h1。4,11mmol/L,15,15STZ,。8。3.试验方法。(1)DNA:,,-80℃。0.2g200μLTE(20mg/mL),。40min400μL,;3μLK,55℃2-3h。,260μL,DNA。、3,DNA。(2)PCR:、、、16SrDNA,PrimerPremier5.0PCR。BLAST()。(350bp)F:5′ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA3′;R:5′GGCACAATCCGCTGGCAACA3′。(165bp)F:5′ACGGGAGGCAGCAGTAGGGA3′;R:5′AGCCGTGACTTTCTGGTTGATT3′。(274bp)F:5′TCCACGCCGTAAACGATGAG3′;R:5′GACACGAGCTGACGACAACC3′。(317bp)F:5′GGAGCAAACAGGATTAGATACCC3′;R:5′AACCCAACATTTCACAACACG3′。(3):PCR、DNAPCR,OD,1μL(2.66×1011,1.85×1011,1.70×1011,3.88×1011),。(4)16SrDNA:(下转第144页)·128·　2010　6[2].[J].,2004,l9:l3.[3].()[J].,2004,42:100-106.[]　2009-11[]　,,,,。(上接第128页)　DNA416SrDNAPCR,。ddH2ODNA,3。PCR。4.数据统计与分析。Prism5.01。x±s,t。P0.05。、　1.小鼠体重和血糖的变化。12,(P0.01),(P0.01)。2.粪便的细菌定量结果。4Ct,PCR()。附表　粪便标本细菌定量(拷贝数/克湿粪)的结果(n=15)9.55±0.858.61±0.72＊＊8.54±1.047.61±1.17＊9.49±1.3310.68±1.45＊7.12±0.937.87±0.84＊　　＊＊P0.01;＊P0.05、　,、、、、,,,。,。,,。,,。16srRNArRNADNA,。16srRNA(50)。PCR,16srRNA。,、、。:DNA,16srRNA,16srRNA[2]。16SrRNAPCR,、。CANI,,,。,,。,,。ARTIN,,、。。,、。,,,[3]。,,、,G-/G+。LPS、、,。,CD4,LPS,。,,,。[][1]Aparecida,D.O.M.,etal.,QuantificationofListeriamonocytogenesinminimallyprocessedleafyvegetablesusingacombinedmethodbasedonenrichmentand16SrRNAreal-timePCR[J].FoodMicrobiol,2010,27(1):p.19-23.[2]Lyra,A.,etal.,Diarrhoea-predominantirritablebowelsyndromedistin-guishableby16SrRNAgenephylotypequantification[J].WorldJGas-troenterol,2009,15(47):p.5936-45.[3]Price,L.B.,etal.,Communityanalysisofchronicwoundbacteriausing16SrRNAgene-basedpyrosequencing:impactofdiabetesandantibioticsonchronicwoundmicrobiota[J].PLoSOne,2009,4(7):p.e6462.[]　2010-05[]　,,,,。·144·　2010　6