荧光定量PCR中探针的荧光修饰基团

荧光定量PCR中探针的荧光修饰基团1.荧光定量PCR两种方法荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBRGreen的荧光染料法和TaqMan探针法，两种方法的特点及应用如下表：名称SYBRGreen染料法TaqMan探针法引物一对特异性的引物一对特异性的引物和一条探针原理SYBRGreen一种DNA结合染料，能非特异地掺入到DNA双链的小沟当中去，在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。特点从实验成本来讲，SYBRGreen是最好的，普通PCR加上一点SYBRGreen荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，出现非特异扩增会影响到定量结果的可靠性与重复性。由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分，其敏感性要比SYBRGreen高出10倍。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。扩增长度SYBRGreen法不超过500bp，一般选择250-400bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开。TaqMan法的扩增片段都很小，几十或是100多，一般不超过300，通常为80－150bp。适用实验该法的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，如需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则SYBRGreen是最好的选择。如果需要进行多通道实验，或是检测很多相同样本的同一基因，最常用的是TaqMan探针法。2.TaqMan探针(1).TaqMan分析探针和引物的设计原则：•探针长度：最大TaqMan探针长度为30个碱基，以获得最佳退火效果。•5’端：探针的5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素，所以荧光标记染料不应结合到G-残基，为了避免此项，所以要避免避免探针的5’端上出现G-残基。•Tm：应介于68-70℃之间。•G-C含量控制在40-80%左右。•避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。•选用比较多的碱基C。设计引物应在设计完探针后进行。•引物设计应尽可能接近探针而又不与探针重叠。良好的距离应为距探针3个核苷酸。•引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过300bp，通常为80－150bp.•引物的Tm应比探针低8-10℃，通常应为至少60℃。长度约20碱基。•避免引物、探针之间的二级结构。•探针应选HPLC纯化。(2).荧光探针保存方法如下：•荧光探针必须避光保存。•干品可于-80℃保存一年以上,如无条件，请于-20℃保存。•强烈建议用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100pmol/µL的储备液，分装成小份，于-20℃保存。应避免反复冻融，使用前，将配制好的储备液稀释成工作液(10pmol/µL或20pmol/µL)。1.荧光基团的种类（1）荧光素类Fluorescein标准荧光素之一，在其基础上进行结构改造，可产生一系列荧光素衍生物。Fluorescein适用于Argon-ionLaser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocallaserscanningmicroscopy）和流式细胞计应用（Flowcytometry）。FITC异硫氰酸荧光素，Fluoresceinisothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，在水中易变坏，不能长久保存。是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感.FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ionLaser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。FITC有两种异构体5-FITC和6-FITC，其中前者在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良更经常使用。FITC-Oligo广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。FAM羧基荧光素，Carboxyfluorescein，绿色荧光，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。FAM也适用于Argon-ionLaser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。FITC、6-FAM、5-FAM都是荧光素标记（Fluorescein），5-FAM与6-FAM互为异构体：而FITC则在与oligo的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键），但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。灵敏度更高。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR。TET四氯-6-羧基荧光素，Tetrachlorofluorescein，是荧光素衍生物的一种。TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的吸收波长与发射波长值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=521/536nm。HEX六氯-6-甲基荧光素，Hexachlorofluorescein，是荧光素衍生物的一种，原理类似于TET，适用于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=535/556nm。TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP。JOE2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）。常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。（2）罗丹明类（Rhodaminedye）R110由三苯甲烷衍生的标准荧光素（Referencestandard）之一，在其基础上进行结构改造，即可产生一系列罗丹明类衍生物。与Fluorescein类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的pH敏感性。罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记蛋白。R110被用于DNA自动测序。TAMRA全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6-TAMRA被广泛使用。TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6-TAMRA适用于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。6-TAMRA主要用于DNA自动测序中。TexasRedTexasRed是一个长波长荧光素，与Fluorescein几乎没有波谱重叠，只适合于Ar-KrLaser的568nm光谱线或He-NeLaser的594光谱线，比Tetramethylrhodamine和LissamineTMRhodamineB波长更长，荧光量更高。TexasRed在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Thirdlabels)。2.荧光基团的选择原则：由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择（探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号）。常与5’端相结合的荧光报告基团：FAM（6-羧基荧光素），TET（四氯-6-羧基荧光素），JOE（2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素），HEX（六氯-6-甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的淬灭基团：TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)，DABCYL（4-（4-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸），BHQ。（信息来自:）1.淬灭基团：BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl2.荧光基团：FAM、TET、HEX、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X、Cy3（TYE™563）、Cy5（TYE™665）、JOE。