第九讲 生物技术概论之基因工程

王丽娟南京工业大学生物与制药工程学院第九讲生物技术概论之基因工程1.基因工程概念基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。是有意识地将把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物一、基因工程的基本过程2、基因工程中常见的工具酶（1）将目的基因片断从细胞内提取，需要基因的剪刀——限制性内切酶。（2）将目的基因与运载体DNA连接，需要基因的针线——DNA连接酶。（3）合成第二条cDNA链或用于标记DNA——大肠杆菌DNA聚合酶。一、基因工程的基本过程3、重组DNA（基因工程）的操作步骤基因工程是生物技术的核心部分。基因工程的操作可以简述如下：一、基因工程的基本过程基因工程的操作流程基因工程的操作包含以下步骤：获得目的基因构造重组DNA分子转化或转染表达蛋白质产物的分离纯化到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为基因文库。文库中基因总数就人来说约有3万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。（1）获得目的基因印迹法的主要步骤：（1）基因文库－DNA用限制性内切酶处理。（2）DNA片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。印迹法的关键是“分子杂交”：利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。探针DNA片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15－20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。（2）目的基因的扩增用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。PCR——把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。PCR法，全称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。PCR操作流程900C500C700CPCR反应分三步完成：第一步——900C高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。第二步——500C温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步——700C温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。FLASH：PCRPCR的三个步骤为一次循环，约需5－10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增106倍，总共只需几个小时。FLASH：PCR（3）构造重组DNA分子首先要有载体。载体有好几种，常用的有：质粒－－环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。噬菌体DNA－－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要的关键酶叫限制性内切酶。此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。（4）转化/转染把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。细菌的接合转化（5）目的基因表达及蛋白质分离进入到寄主细胞的目的基因还要能表达产生有活性的目的蛋白，这些目的蛋白可以是某种蛋白质药物，也可以表达某种抗性性状（如植物的抗病性和抗旱性）。蛋白质的分离纯化——生物分离技术重组DNA分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。生产基因工程产品的生物反应器二、基因工程技术及应用（1）在医学上的应用基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽类药物。（2）提高奶酪产量生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。（3）转基因动物和植物转基因动物首先在小鼠获得成功。“乳腺反应器”工程：转基因动物技术已用于牛、羊，使得从牛/羊奶中可以生产蛋白质药物。转基因植物亦已在大田中广为播种。随着转基因作物的普及，目前世界已经有很多食品中含有转基因成分，如食用油、土豆泥、番茄酱、豆制品，海关检测表明60%的进口食品中含有转基因成分。转基因食品的安全性目前世界上尚未发现转基因食品对人类健康的危害，但是安全性仍然需要长期监测。各国制定了相关法规，中国《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物标志管理办法》（包括大豆、玉米、油菜、番茄及其加工产品）转基因食品（4）工程菌在环境工程中应用美国GE公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。三、人类基因组计划1、人类基因组计划产生的背景2、人类基因组计划任务和意义3、基因研究是把双刃剑现代自然科学的发展使人类成为地球上的主宰，但人类对自身的认识和保护却不尽如人意。全球约有20%-50%的人每天备受各种慢性疾病的折磨；我国11%的人患有高血压；4.2%人有不同程度的残疾；2.5%的人智力低下；肿瘤、心血管疾病等主要死因已成为驱除不掉的幽灵；艾滋病、疯牛病等新的传染病使人们对未知灾难又有了新的恐惧。人类对人体自身的奥秘知之甚少，有鉴于此，研究人类基因组，揭示人类基因的奥秘，认识人类的遗传信息并进而了解人类各种疾病与基因的相互关系，从而达到从根本上预防人类疾病发生以及有效根治疾病。1、人类基因组计划产生的背景如果把人类基因组比喻为一本有10亿单词的百科全书,这本书可分为23章，每章为一个染色体。而每一个染色体上又包含数千个被称为基因的“故事”。这些故事由一系列3字母单词组成，其中每个单词是4个基本化学即字母即：G，C，A，T这4种碱基的任意排列组合。人类基因组计划正是要读出这30亿个碱基，也就是测出人体所有染色体30亿碱基对的排列顺序。何为基因组计划？人类基因组计划的主要任务是：找出人体的约10万个基因，确定30亿个碱基对的排列顺序，进行数据分析，认识人类的遗传信息。其意义在于揭示人类基因的奥秘，并进而了解人类各种疾病与基因的相互关系，从而达到从根本上预防人类疾病发生以及有效根治疾病，生命现象将在分子水平得到解释。2、人类基因组计划任务与意义人类基因组计划发展过程:•1986[美]Dulbecco首次提出了“人类基因组工程”。原计划约10-15年完成，耗资30亿美元，其宏伟的程度堪与Manhatto原子弹计划和Appolo登月计划相提并论。•19904月美国宣布开始实施人类基因组测序工作。•1999破译出人类第22号染色体的遗传密码。•2000完成了人类第21号染色体的测序。•预计从原定的2003年6月提前到2001年6月完成。•2000年6月26日美，英,日，德，法，中六国共同宣布人类基因组工作草图绘制成功。•2000年•3月塞莱拉公司宣布完成了果蝇的基因组测序。•12月14日英美等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全部破译一种植物的基因序列。•2001年:1、2月，HGP和美国塞莱拉（Sequencing）公司将各自测定的人类基因组工作框架图分别发表在Nature和Science上，这表明人类基因组计划（HGP）进入了一个展新的阶段。•2003年4月14日•美，英日，德，法，中六国科学家完成了人类基因组序列图的绘制，实现了人类基因组计划的所有目标。•2003年人类表观基因组计划(HumanEpigenomeProject)于10月7日正式启动。这是世界上首项针对控制人类基因“开”和“关”的主要化学变化进行的图谱绘制工作，它将帮助科学家建立人类遗传与疾病之间的关键联系。2004年10月国际人类基因组计划合作组织在《Nature》杂志上宣布误差小于10万分之一的人类基因组完成图已成功绘就。已将原来15万个“缺隙”减少到341个。完成图显示人类基因组只含有2～2.5万个基因，比原来的估计要少。基因革命，未来让人们看到具体的成果人类基因组研究所所长柯林斯认为，图谱的最大用途是可以用于医疗诊断。今后医生可以把病灶告诉有遗传倾向的人，让他们设法避开日后发病的危险。美国国家人类基因组研究所对未来25年做了预测：2-3年内绘制出覆盖率为100%的序列图，同时制订有关法律；2002-2010年，对癌症、糖尿病等疾病将出现相关基因的检测试验，对血友病将出现临床基因治疗方法；2015年，将研究出适应个人基因组合的治疗方法，可治疗包括癌症在内的很多疾病；2025年，医生将有能力修复基因缺陷，某些如贫血之类的先天性疾病从此将成为历史。到2050年,许多病症将会在症发前就被消灭。1999年5月，中国加入这一研究计划，负责测定3号染色体上三千万个碱基对，中国因此成为参与这一研究计划的唯一发展中国家。中国科学家仅用半年时间就完成所承担的任务。中国现在的测序能力排名第四，在美、英、日之后，在德、法之前。华大基因研究中心的测序能力在参与人类基因组计划的全世界16个实验室中，排名第七。中国科学家做了什么？是否参与“计划”的讨论持续了十年两种意见：△大多数科学家主张把有限的基金投入到基因组的下游工程——生物基因开发上。这是建立在上游工程——基因测序当选据公开、成果共享的基础上。如果所有的基因图谱都向外国买，中国买不起。21世纪两大支柱产业——信息产业的核心技术已被外国掌握，我们只能以市场以代价换技术。在21世纪，我们的健康需要人类基因组计划，我们的医药工业需要它，我们的农业、畜牧业都需要它。△对虾病毒事例90年代中期我国对虾受病毒侵害,造成惨重损失。为了对付这种病毒，需要对病毒的基因组进行测定。然而当时中国没有这种能力做，只好委托外国公司做。这个工作量只相当于这次1%的1%，只需花30万元，而让别人来做花掉180万元不说，还要出让1/3的知识产权。1998年8月，中科院遗传所的“人类基因中心”挂牌，次年2月，中心决心搞基因组测序，创造加入国际人类基因组计划的条件。图谱绘制仅是一小步对完全理解人体基因系统而言，绘制出基因草图只是第一步。有了基因图，研究人员可能需要几十年时间才能破译这些基因组。关键是破译这些基因的作用！！只有破译才能利用！中国已经开始把这一成果应用于水稻作物的改良。《关于开展中国超交水稻基因组研究》协议，并正式启动。积极筹划对家猪进行全基因组测序。目前已经进入后基因组时代基因工程——蛋白质工程——应用※基因保护比尔.盖茨说，第二个“比尔.盖茨”将出现在基因领域，为此他看好这一新领域，向几个实验室投了不少钱。中科院“到2009年，全世界的基因产业带来的销售额将达450亿美元。”“基因就是钱”，由于其孕育着巨大的商业利润，争夺基因资源的世界大战已经打响。中国基因资源为世界首富。觊觎中国基因资源的多了起来：赛莱拉公司在台湾和上海登陆；日本的龙基因组公司在大连设立DNA模扳制备自动线；某国在中国采集健康老人血样。1997年我国遗传学泰斗谈家桢致函国家领导人：“我国人类基因资源流失情况已十分严重，如不采取有力措施，我国基因资源将被掠夺殆尽，很快变成外国公司的专利。”1998年科技部和卫生部联合出台了有关人类遗传资源的管理暂行办法。只有建立我国强大的基因研究能力，并占有自己的基因专利，才能有效防止外国对中国的资源掠夺。基因发现一个少一个，能抢一个是一个。谁占有较多的基因专利，谁就在人类基因的商业开发方面（包括基因药品物、基因诊断、基因治疗）抢得先机。科学技术进步从来就是双刃剑。基因隐私权假若知道现在这个20岁的人到了50岁时会患一种致命的疾病,谁